Двойно директно инжектиране на кръв в цистерна магна като модел на субарахноидален кръвоизлив

Обобщение

В този протокол описахме стандартизиран модел на субарахноидален кръвоизлив (SAH) чрез двойно инжектиране на автоложна пълноценна кръв в цистерната magna. Високата степен на стандартизация на процеса на двойно инжектиране представлява среден до остър модел на SAH с относителна сигурност на смъртността.

директно

Резюме

Въведение

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички процедури бяха проведени под надзора на H. Castel в съответствие с френския комитет по етика и насоките на Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета за защита на животните, използвани за научни цели. Този проект е одобрен от местната CENOMEXA и националните етични комитети за изследвания и изпитвания върху животни. Мъжки мишки C57Bl/6J Rj (Janvier) на възраст 8-12 седмици бяха настанени при стандартни контролирани условия на околната среда: 22 ° C при 1 ° C, 12 часа/12 часа цикъл светлина/тъмнина и вода и храна ad libitum.

1. Настройте SAH хирургия и се подгответе за инжектиране

Препарат за второ животно (8-10 седмици от мъжки мишки C57BL/6J)

3. SAH индукция

4. Следоперативно проследяване и край на експеримента

  1. Непосредствено след операцията изолирайте и разположете мишката за декубитална язва с одеяло за оцеляване на гърба си в отворена кутия, докато се възстановявате.
  2. Претегляйте и наблюдавайте поведението на всяка мишка ежедневно до жертвата (напр. D7 след операцията).
  3. Значителна загуба на тегло (> 15% от теглото) се отбелязва класически сред крайните точки на човека. "Извита поза назад", бавни движения, прострация, необичайно формиране на глас от наранявания и/или значително агресивно поведение също са важни признаци на страдание на животните. Ако се появи някой от тези признаци или комбинация от признаци, наблюдението на животното ще се увеличи в рамките на часове след появата им. Ако хуманното отношение към животното се влоши или не се подобри в рамките на 48 часа, се счита, че се стига до непоносимо страдание и се извършва евтаназия.
  4. По време на избора жертвайте упоени мишки чрез обезглавяване и събирайте мозъци за по-нататъшен анализ.
  5. Евтаназия (обезглавяване) след изофлуранова анестезия (5%).

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

SAH церебрален вазоспазъм
Както El Amki et al. 22 показва базиларна артерия (BA), средна церебрална артерия (MCA) и предна мозъчна артерия (ACA) CVS присъства в SAH модела чрез двойно интрацистернално инжектиране на кръв в ACA, MCA или BA от D3 до D10 след операцията. Накратко (Фигура 2А), след жертване и обезглавяване на мишки, мозъците бяха събрани и фиксирани в 4% параформалдехид (PFA) и след това замразени при -80 ° С, преди да бъдат нарязани на 20 m напречни филийки с криостат. Оцветяването с хематоксилин и еозин е използвано за BA (интраурална е0,40 mm; Bregma -3,40 mm), MCA (интраурална 2,58 mm; Bregma -1,22 mm) и ACA (интраурална e4,90 mm; Bregma 1,10 mm), за да се даде възможност за идентифициране на CVS чрез систематично записване на изображения на цветни стъкла с помощта на микроскопска камера. За да се оцени отсъствието или наличието на макроскопски CVS, съотношението на лумена към дебелината на стената беше изчислено за всяка оцветена артерия. Колкото по-ниско е съотношението, толкова по-тежък е CVS. Например, CVS се наблюдава при BA в мозъка на SAH в сравнение с мозъка на фалшиви мишки (Фигура 2B), но и в други големи мозъчни артерии (MCA, ACA, данните не са показани 22).

Дискусия

В този контекст моделът е подобен на клиничната физиопатология на SAH по отношение на CVS, свързана със SAH. По принцип CVS се появява в модела на ендоваскуларна перфорация в MCA и BA след 1 час при плъхове 40 и след 3 дни при мишки 17. В прехиазматичния модел на цистерна за инжектиране на кръв честотата на CVS е показана между два дни 49 и осем дни 37 при плъхове. При модела с двойно инжектиране в цистерна магна при плъхове CVS се развива между 10 минути 29 и 3 дни 31. Ние сме първите, които описват кинетичния външен вид на CVS в миши модел на SAH чрез двойно инжектиране, установяване на CVS в основните мозъчни артерии (ACA, MCA и BA) в продължение на 3 дни и персистиращо до 10-ия ден след SAH 22, близо до това какво се наблюдава при пациенти със САХ. Този последен модел може да се определи като квалифициран модел на SAH, достатъчно строг, без смъртност, за да позволи изследването на механизми и терапевтични средства, които са насочени към CVS.

Друг неконтролиран параметър в модела на SAH са възможните вариации в средното артериално кръвно налягане (MABP), предизвикани от прекалено бърза процедура за кръвна инжекция 27. Всъщност MABP обикновено се повишава остро след експериментален SAH, за да поддържа церебрално перфузионно налягане, и след това се връща обратно към изходното ниво. В модела SAH инжектирахме кръв или aCSF (приблизително 10 l/min) с ниска скорост, за да избегнем тези MABP вариации. По отношение на невробиологичните събития в този модел, имитиращи тези, наблюдавани при хора, по-рано демонстрирахме, че моделът на двойна кръвна инжекция на SAH предизвиква дълготрайно CVS, микротромбоза и мозъчно увреждащо мозъчно увреждане, включително дефектна параваскуларна дифузия от ден 3 до ден 10 след видях 22. Въпреки това, последните данни, описващи, че CSD участва в свързания с SAH DCI 13, силно подкрепят преследването на този тип проучване в модела с двойно инжектиране на мишка. Това трябва да даде възможност за научни пробиви относно положителните ефекти на новите терапии, насочени към CSD.

В заключение бих искал да кажа, че двойното инжектиране на цяла артериална кръв в модела на цистерната magna е усвоен модел, който осигурява лесен начин за имитиране на физиопатология на човешкия SAH, включително CVS, микротромбоза, съдово възпаление, неврологичен дефицит и смъртност. Той представлява валидиран модел за тестване на нови терапевтични подходи за лечение на свързана със SAH морбидна смъртност.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.