ДНК диагностика и типизиране на ДНК
Фигура: II.30. Генетични последици от мутации, възникващи в генома на човешки соматични клетки на различни етапи от ембриогенезата
Областите на локализация на клонинги на мутантни клетки с различни размери в човешкото тяло са боядисани в черно
Изследванията показват, че повечето и вероятно всички човешки заболявания са свързани с мутации, които променят нивата на експресия на специфични гени. Мутациите в определени гени нарушават функционирането на биохимичните системи, което в крайна сметка води до развитието на съответните патологични състояния на организма (фиг. II.30). В случай, че се появят мутации в генома на човешки зародишни клетки, всички соматични клетки на потомствен организъм, който се развива от мутантна зигота, образувана от сливането на мутантни гамети по време на оплождането, ще съдържат определената мутация. Колкото по-късно се появява соматична мутация в човешката онтогенеза, толкова по-малък е размерът на клонинга на мутантни клетки във възрастния организъм. Ако мутацията е доминираща, т.е. патологична мутантна черта, определена от мутантния ген, се проявява, дори ако копие на нормален ген, получен от друг родител, присъства в соматични клетки, тогава възниква наследствено заболяване.
В случаите, когато мутацията, определяща мутантния фенотип, е рецесивна (ефектът му се проявява само в хомозиготно състояние, при което от всеки от родителите се получава един и същ мутантен ген), можем да говорим за предразположения хетерозиготен организъм за съответното заболяване и превозвач мутант ген. Всъщност, организъм, в който ефектът от рецесивна мутация е маскиран от функционирането на друг, пълноправен алел, външно (фенотипно) изглежда нормален. Подобен организъм обаче е много по-вероятно да даде болни потомци в брак с носител на същия мутантен ген, което е една от причините за забраната на тясно свързани бракове. От друга страна, носителите на мутантни гени в хетерозиготно състояние могат да претърпят соматична мутация в съответния алелен ген на соматични клетки, което също ще причини развитието на придобито генетично заболяване. Като един от примерите за такова заболяване вече разгледахме ретинобластом, онкологично заболяване, което засяга ретината, най-често в детска възраст. Това заболяване се развива в два етапа: първо, тялото на детето получава мутант ген от един от родителите RB1, който е рецесивен онкоген (антионкоген), а след това в онтогенезата в една от соматичните клетки в резултат на мутация, второто му копие се инактивира, което причинява клетъчно злокачествено заболяване и развитие на тумор. Същият механизъм лежи в основата на появата на някои форми на диабет, както и на редица ракови и автоимунни заболявания.
Традиционната диагностика на наследствени и инфекциозни заболявания се основава на подробно проучване на симптомите и провеждането на множество биохимични анализи, включително култивиране на патогенни микроорганизми върху сложни хранителни среди. В същото време идентифицирането на безсимптомно пренасяне на вредни алели и патогенни микроорганизми се превръща в изключително трудоемка задача. По-специално, традиционните цитогенетични методи могат да разкрият само някои големи хромозомни пренареждания в човешкия геном: удължени делеции и транслокации на генетичен материал, загуба или придобиване на цели хромозоми. В същото време малки делеции, транслокации и вмъквания, както и точкови мутации, които са най-честите промени в генетичния материал, остават неоткрити. Същото се случва и при диагностицирането на безсимптомно пренасяне на инфекциозни агенти с бактериална и вирусна природа, например вирусът на човешкия имунен дефицит, който в латентния стадий на инфекцията може да присъства в човешкото тяло само в малък брой копия.
Наскоро разработени нови методи за молекулярна биология, и особено методът PCR, значително улесниха диагностиката на наследствени и инфекциозни заболявания. В този случай се откриват мутации в ДНК на клинични проби, а асимптоматичното присъствие на патогени се открива чрез наличието на геномна ДНК или РНК на съответните вируси или бактерии.
Всички диагностични методи на ДНК се основават на три основни принципа на молекулярната биология (Фигура II.31). Това е преди всичко съществуването на взаимно допълващи се взаимодействия между двуверижните молекули нуклеинова киселина (първи принцип), които след денатурация, последвана от ренатурация (втори принцип), им позволяват да се намерят точно и да възстановят първоначалната вторична структура. Ако в процеса на ренатурация на нуклеинови киселини към пробите се добавят къси олигонуклеотиди (сонди или праймери), ковалентно свързани към всяко белязано съединение, тогава, поради допълнителни взаимодействия, те са свързани с онази част от нуклеиновата киселина, която съдържа нуклеотидната последователност, строго съответстваща на нуклеотидната последователност на сондата или праймера (трети принцип). Следователно, наличието на етикет, свързан с нуклеиновата киселина с висока точност, показва наличието на желаните нуклеотидни последователности в анализираната проба.
Фигура: II.31. Три молекулярно генетични принципа, залегнали в основата на ДНК диагностиката
Звездичките показват наличието на радиоактивен, флуоресцентен или друг етикет в олигонуклеотидни сонди или праймери в единия от краищата им
Съвременните методи на ДНК диагностика се използват широко в медицината за откриване на мутации при наследствени (или придобити) заболявания и за ДНК типизиране на организми (фиг. II.32). ДНК диагностиката на наследствени и придобити заболявания може да се състои както в откриване на известни, вече описани мутации, така и в търсене на нови мутации, водещи до същото патологично състояние на тялото. Типиране на ДНК се нарича търсене на генотипни признаци в микро- или макроорганизъм, които позволяват той да бъде идентифициран и (или) приписван на една или друга систематична група.
Фигура: II.32. Приложение на методите на ДНК диагностика в медицината