Cis-9, транс-11 конюгирана линолова киселина инхибира възпалителните процеси при модели на астма in vitro и при
1 ОТ ИНСТИТУТА ЗА ХРАНИТЕЛНИ НАУКИ НА FRIEDRICH-SCHILLER-UNIVERSITÄT JENA LEHRSTUHL ХРАНИТЕЛНА ФИЗИОЛОГИЯ Cis-9, транс-11-конюгирана линолова киселина инхибира възпалителните процеси при модели на астма in vitro и in vivo докторска дисертация Фармацевтичен факултет на университета „Фридрих Шилер“ Йена от Анке Магдалена Яудсус от Мехтерщат Йена, 2008 г.
2 рецензенти: 1. проф. Д-р Герхард Яхрейс 2. Проф. Д-р Стефан Лорковски 3. Проф. Д-р Д-р Лампи Alfonso Дата на спора: 26 февруари 2009 г.
3 Родителите ми Анемари и Дитмар и всички деца в проучването CLA
4 СЪДЪРЖАНИЕ Списък на съкращенията V Списък на фигури VII Списък на таблици IX 1 Въведение Определение на бронхиалната астма и епидемиология Диагноза Патофизиология Имунологични основи Алергична сенсибилизация Причини за алергична реакция и фактори на риска Генетика Фактори на околната среда Инфекции и хигиенна хипотеза Хипотеза на хипотезата Хипотеза на хипотезата Хипотеза на диетата CLA синтез Бактериални химични физиологични ефекти Рецептори, активирани от пролифератор на пероксизом (PPAR) Членове на семейството PPAR Структура Контрол на генната експресия PPARs и възпаление на дихателните пътища CLA развиват противовъзпалителни ефекти чрез PPARs Цел Хипотеза Специална цел Част I: Имунология In vitro модел In vivo модел Част II: Метаболизъм Материал и методи In vitro модел Клетъчни биологични методи Стимуланти и инхибитори Мастни киселини PPARγ антагонист GW липополизахарид The Z elllinie BEAS-2B отглеждане дългосрочно съхранение стимулиране на BEAS-2B изолиране и пречистване на еозинофили поточна цитометрия кокултура на BEAS-2B и еозинофили I.
7 СЪДЪРЖАНИЕ 9.4 Вграждане на c9, t11-cla в BEAS-2B след 24 h откриване на t7, c9- и t8, c10-cla в c9, t11-cla-peak Допълнено масло: c9, богато на t11-cla триазилглицерол Допълнено масло: CLA-Mix Triazylglycerol Разпределение на мастни киселини след диета, богата на зехтин Декларация Благодарности Публикации и принос към конференцията CV IV
28 ВЪВЕДЕНИЕ (Chin et al. 1994). Тъй като обаче повечето от изследванията са проведени с изомерни смеси, които съдържат c9, t11-cla и t10, c12-cla в приблизително равни части и малки количества от други изомери, наблюдаваните ефекти не могат да бъдат ясно приписани на единия или другия изомер. Подобрените методи за синтез за представяне на отделните изомери сега позволяват много по-диференциран поглед върху съвсем различните и понякога противоречащи си начини на действие на c9, t11-cla и t10, c12-cla (табл. 2 и 3). 16.
48 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ Детекция: Ензимен реагент: Вторично антитяло: биотинилиран анти-човешки IL-8 mAb (клон G 265-8, BD Pharmingen): 1 µg/ml в блокиращ буфер Avidin-HRP (BD Pharmingen) 1: 1000 в блокиращ буфер Субстратен реагент: TMB 1: 100 в Gallati буфер TMB: 240 mg 3,3,5,5-TMB (Fluka, Neu-Ulm, D) 5 ml DMSO (Sigma) 5 ml етанол Gallati буфер: Цитратен буфер: Стоп Разтвор: 0,034% H 2 O 2 (Merck) в цитратен буфер 33,6 g монохидрат на лимонена киселина в 400 ml дестилирана вода. разтваря се с 4 N KOH, регулира се до ph 3.95, с дестилирана вода. до 500 ml 1 M H 3 PO 4 (всички Merck) ELISA за количествено определяне на ECP ELISA за откриване на ECP се провежда с помощта на наличен в търговската мрежа комплект (MBL, MoBiTec, Göttingen, D) съгласно препоръките на производителя. Съдържащите се в комплекта 96 плочи за микроямки вече бяха покрити и разтворите бяха готови за употреба или бяха приготвени съгласно инструкциите. Границата на откриване на този комплект беше 0,125 ng/ml. 36
49 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ In vivo модел Женски BALB/c са получени от Harlan Winkelmann (Borchen, D) и са били на възраст 6-8 седмици, когато са били приети. Всички експерименти са одобрени от Държавната служба за безопасност на труда, защита на здравето и техническа безопасност Берлин (LAGetSi) като продължение на съществуваща заявка за експерименти с животни (Reg G 0247/03) съгласно германския Закон за хуманно отношение към животните. 3.4 Добавени с фураж CLA масла C9, богат на t11-CLA триазилглицерол (табл. 6, фиг. 13) беше извършен, използвайки метода за превръщане на метил рицинолат () и приготвянето на CLA-Mix (табл. 6, фиг. 13) Катализирана от основи изомеризация на линолова киселина на базата на произведено шафраново масло (и двете Cognis, Illertissen, D). Таблица 6: Състав на мастните киселини на препаратите CLA. GC анализ. Мастна киселина [% FSME] c9, t11-бистър TAG CLA смес TAG C14: 0 0 0 C16: 0 0,2 2,6 C18: 0 0,5 2,8 C18: 1c9 1,8 14,4 C18: 1c11 0,3 0,7 C18: 2n6 3,1 0,3 C18: 3n3 0,2 0 C20: 0 0,1 0 C20: 1 0,5 0 C20: 5n3 0,4 0 CLA 86,6 78,0 Други 6.7 1.4 Съкращения: TBE метилов естер на мастна киселина, TAG триазилглицерол 37
50 МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ A c9, богат на t11-cla ДЕН B CLA смес ДЕН 1,4% 0,3% 0,4% 22,1% c9, t11-cla 0,1% 0,4% c11, t13 -cla t10, c12-cla c9, c11-cla t9, t11-cla 45.0% 52.6% 74.9% Фиг. 13: Изомерно разпределение на CLA препаратите. A: c9, t11-cla-богат TAG. Б: CLA-Mix ДЕН. Показан е процентът от общия CLA. HPLC анализ (9.5) Режим на хранене След 5 дни адаптиране към условията на отглеждане (22 ° C, 12-часов цикъл светлина/тъмнина, макс. 5 животни/клетка в системата на IVC шелф), животните бяха разпределени на случаен принцип в тестовите групи. Пробните диети се основаваха на поддържаща диета V1535 от ssniff (Soest, D) и бяха специални поръчки, обогатени със съответните масла (табл. 7). Таблица 7: Състав на мастните киселини на тестовите диети [g/kg]. Основен контрол на фуража Първичен контрол на превенцията Вторична профилактика c9, t11- CLA CLA-Mix мастна киселина Добавено масло 1,5% слънчогледово масло d, 3% зехтин d, 5% слънчогледово масло 1,5% c9, t11-прозрачно TAG C14: 0 0,1 0, 1 0,1 0,1 0,1 0,1 C16: 0 4,7 5,6 5,0 5,6 4,7 5,1 C18: 0 0,8 1,4 1,2 1,4 0,9 1,2 C18: 1c9 6,2 10,0 16,1 10,0 6,5 7,7 C18: 2n6 18,0 27,8 18,8 27,8 18,4 18,3 c9, t11-cla, 9 5.0 c9, c11-cla, 9 0.1 t10, c12-cla, 9 C18: 3n3 2.3 2.5 2.4 2.5 2.5 2.3 C20: 0 0, 1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 C20: 1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2 C20: 4n Други 0,3 0,3 0, 3 0,3 0,7 0,3 1,3% CLA-Mix ДЕН 38
56 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ Таблица 9: Грундове и сонди, използвани за усилване на PPARγ. Праймер за генна нуклеотидна последователност FW 5 -TAA CTG CCG GAT CCA CAA A-3 PPARγ праймер RV 5 -ATC TCC GCC AAC AGC TTC T-3 сонда 5 fam-ctg TCG GTT TCA GAA GTG CCT TGC-3 там праймер FW 5 -GTT TGA GAC CTT CAA CAC CCC A-3 ß-актинов грунд RV 5 -GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA-3 сонда 5 vic-cca TGT ACG TAG CCA TCC AGG CTG TG-3 там 10 µl шаблон (100 ng) бяха 40 μl от оптимизираната реакционна смес се пипетира (табл. 8) и се анализира в три екземпляра върху оптични 96-ямкови плаки (ABgene, Epsom, UK) в PCR система в реално време (Applied Biosystems), като се използва следната температурна програма: Таблица 10: Температурна програма за усилване на PPARγ. Температура [C] Времеви цикли min min s 60 1 min 40 Поредица от разреждания на обща РНК, екстрахирана от LA-4 клетки, беше включена като вътрешен стандарт при всеки цикъл. Протеинови биохимични методи ELISA за определяне на IL-5 в BAL. Провеждане на ELISA: Състав на разтворите: Покритие: Първично антитяло: Anti-miš IL-5 mAb (клон TRFK5, BD Pharmingen): 2 µg/ml в буфер за покритие Буфер за покритие: 8,4 g NaHCO 3, в 1 l дестилирана вода . разтваря се, регулира се до рН 8,2 с 10 N NaOH промивен буфер: 0,05% Tween 20 в PBS 44
62 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ ANOVA). Тъй като само основните ефекти от диетите могат да бъдат интерпретирани за този параметър, разликите между групите бяха определени с помощта на несдвоени T-тестове на Student. P enh кривите бяха оценени с помощта на ANOVA за повторни измервания. Сравнението на c9, t11-cla OVA групите със и без GW9662, както и данните от подхода за вторична профилактика и тъканните концентрации на мастните киселини, беше проведено с помощта на едновариатен дисперсионен анализ (ANOVA). Влиянията на диетите върху състава на мастните киселини на изследваните органи бяха оценени с помощта на корелационен анализ. Прагът за значимост е зададен с вероятност за грешка от 5% (р 0,05). 50