Човешки Ex Vivo модел на атеросклеротична плака за изследване на протокол за биология на лезиите (преведен на немски)

Обобщение

Атеросклерозата е хроничен възпалителен процес. Този ръкопис илюстрира лесен за използване модел ex vivo за изследване на пресни каротидни или коронарни сърдечни плаки. Моделът ex vivo позволява изследване на възможни вещества върху възпалителната среда в човешките артериосклеротични лезии и резултатите могат да бъдат изследвани с различни методи.

модел

Резюме

Въведение

Атеросклерозата като хронично възпалително заболяване е една от водещите причини за смърт в индустриализираните страни 1/2. Усложненията на атеросклерозата, особено острия коронарен синдром, са свързани с разкъсване на уязвимите лезии, водещи до атеротромбоза и съдова оклузия 3. Вроден и придобит имунитет изглежда участва във всички етапи на 2.4-5 атерогенеза. Въпреки че е постигнат значителен напредък в лечението на инфаркт, ефективната профилактика на атеросклерозата и сърдечно-съдовите странични ефекти все още не е решена. По този начин изучаването на биологията на уврежданията е важно за увеличаване на познанията ни по патофизиологията на атеросклерозата и за да се даде възможност за идентифициране на нови терапевтични цели и разработването на нови терапии.

В много случаи се използват миши модели за изследване на патофизиологията на специфични заболявания. Въпреки това, изучаването на атерогенеза с помощта на модели на мишки се придружава от няколко ограничения: (1) Обикновено атеросклеротичните мишки получават диета с висок холестерол. Нивата на холестерола в тези модели не могат да се сравняват с тези при пациенти с повишени нива на серумен холестерол 6. (2) Съществуват значителни разлики между мишата и човешката имунна система; по този начин Foxp3 е специфичен маркер за миши регулаторни Т клетки, докато експресията на човешки Foxp3 в човешки Т клетки не придава непременно регулаторен фенотип 7. Също така парадигмата Th1/Th2, както при хората, не е дефинирана за Т клетки на мишката. Напълно преносими клетки. (3) Набор от маркери, които се използват за идентифициране на миши моноцити и макрофаги, като F4/80 и маркери от класически (M1) срещу алтернативни (M2) модели на активиране, които не присъстват в човешки миелоидни клетки 8. (4) Установено е, че генната експресия на миши и човешки моноцити в периферна кръв е от съществено значение 9.

По този начин, за да разширим разбирането си за хроничните възпалителни процеси при човешката атеросклероза, трябва да използваме модели на работа с човешка тъкан, кръв или клетки. Тук ние описваме модел на култура на тъканна човешка плака, която позволява изследване на възможни нови вещества в концепцията за човешката възпалителна лезиологична биология.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

1. Пригответе среда, както следва

  1. Културна среда: среда RPMI.
  2. Станете 10% фетален телешки серум (FCS).
  3. Със 100 U/ml пеницилин G и 100 g/ml стрептомицин.

2. Съхранявайте свежи цилиндри с плака до употреба

  1. Каротидната ендартеректомия на пациенти със или без исхемични симптоми (инсулт, преходна исхемична атака) със значителна каротидна стеноза се извършва от съдови хирурзи и коронарна сърдечна ендартеректомия по време на коронарен байпас от сърдечни хирурзи. Сънните/коронарните плаки трябва да бъдат премахнати блоково, за да се запази структурата на плаката, както е описано по-горе 5.
  2. След изкореняване на плаката, поставете пробата в средно напълнена епруветка и я съхранявайте върху лед (плаката трябва да бъде напълно покрита със среда) до употреба.

4. След определено време за събиране на парчета тъкан от плака

  1. Шоково замразяване на парчетата плака за изолиране на иРНК и синтез на кДНК (за подробна информация вижте Протокол col, раздел 5).
  2. Супернатантната течност и се съхранява при -20 ° C за ELISA анализ.
  3. За Western blot, смачкване и лизис на плака. Филтрирайте лизата през центробежно филтърно устройство с 0.65 µm и 0.1 µm.
  4. Вградете плака в тъкан-тек или парафин за имунохистохимично оцветяване.

5. Извличане на РНК от култивирани парчета плака

  1. Използвайте TissueLyser за хомогенизиране.
  2. Изолирайте РНК с помощта на комплекта (вижте таблицата с материали) в съответствие с инструкциите на производителя.
  3. Определете количеството и качеството на РНК в пробите с помощта на спектрофотометър.
  4. Използвайте комплекта Boehringer cDNA за обратна транскрипция в съответствие с инструкциите на производителя.
  5. За количествена PCR използвайте например PCR комплекта на Roche в реално време със SYBR Green.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Първо, ние показваме зависими от времето промени в възпалителното съединение на нестимулираните култивирани атеросклеротични лезии, чрез количествена полимеразна верижна реакция в реално време (qRT-PCR) (Илюстрация 1) анализирани. По време на култивирането на плака може да се наблюдава повишаване на активността на възпалителната лезионна среда. Не е открита разлика след 3 часа спрямо без култура (данните не са показани). След 8 часа култивиране на плака открихме само леко регулиране на някои молекули като IL-6, но не и на TNF-a и IFN-g, докато след 24 часа имаше регулиране на различни молекули като TNF a, IL-6 и IFN- G. Забележително е, че колкото по-дълго е времето на култивиране на плаката, толкова по-голяма е вариацията в молекулната експресия.

Второ, за да се демонстрира възможността за въздействие върху възпалителната среда при атеросклеротични лезии, представяме резултати от парчета плака с 1 µg/ml LPS за 3 часа, измерени чрез qRT-PCR (Фигура 2) инкубира. Нестимулираните парчета плака служат като отрицателни контроли. Установихме, че LPS индуцира значително увеличение на степента на активиране на възпалителното съединение в рамките на атеросклеротични лезии. Различни цитокини (IL-6, TNF-a и др.)., Фиг. 2A-B), Хемокини (CCL2 и др., Не са показани), адхезия (ICAM-1, не е показана), дестабилизираща плака (матрична металопептидаза 9 (MMP9), не е показана) и протромботични молекули (фактор на von Willebrand, 2С, Тъканният фактор не е показан) се регулират чрез LPS инкубация.

Трето, за да се оцени количеството протеин, нивата на култивираните лезии бяха анализирани с ELISA и нарушени плакови тъкани чрез Western blot (Фигура 3D). В Фигури 3A-C показваме ELISA анализ на IFN-g, MCP-1 и TNF-a в супернатанта на култивираните проби, инкубирани с LPS или контрола за 8 h. В допълнение към Western blot анализ (фосфорилиран) ERK 1/2 се натрошава и плаката се лизира, или с LPS-стимулиран контрол и се използва в Фигура 3D показани.

Дискусия

Тук представяме ex vivo модел на култура на плака, за да изследваме влиянието на потенциално значимите вещества върху биологията на атеросклеротичните лезии. Основното предимство на тези ex vivo методи е възможността за оценка на влиянието на споменатите вещества върху възпалителните клетки и техните взаимодействия между клетъчните и възпалителни пътища и каскади в човешките атеросклеротични лезии. Няколко полезни метода (напр. RT-PCR, Western blot, имунохистохимия, поточна цитометрия, ELISA) помагат да се създаде цялостен анализ на ефектите на веществото от интерес върху възпалението на атеросклеротичните лезии.

Възпалителните процеси при миша атеросклероза са добре разбрани, също благодарение на миши модели на свръхекспресия или липса на определени гени, които представляват интерес 11. Резултатите обаче не винаги съответстват тясно на хората 6-9,13. Атеросклеротичните мишки обикновено получават високопатологична холестеролова диета 6. Освен това е известно, че имунната система между хората и мишките показва значителни разлики 9.7. Тук представяме ex vivo модел на култура на плака, който позволява изследването на влиянието на интересуващо вещество върху инхибиторното съединение при човешки атеросклеротични лезии, както е описано от Niessner et al. 14 показани. В допълнение, различни допълнителни методи могат да бъдат използвани за анализиране на резултатите от експеримент с култура на плаки, сравним с проучвания върху мишки. Следователно, ex vivo моделът отваря възможността за замяна на проучвания на мишки in vivo в някои случаи и може да представлява отличен метод за преодоляване на разликата между предполагаема атеросклероза, стимулираща молекула в мишата система и транслация в човешката биология.

Ex vivo човешкият модел за атеросклероза не е сравним с in vitro експерименти с клетки. Клетъчните линии могат лесно да се съхраняват и култивират, но не са фенотипично и функционално идентични с първичните клетки. Пресни клетки могат да бъдат получени чрез редовно вземане на кръв, но понякога е трудно да се култивира и културата е подчинена на много фактори. Освен това, използвайки експерименти in vitro с клетъчни култури, не е възможно да се изследва влиянието на специфични молекули върху инхибиторното съединение при атеросклеротични лезии. По този начин, експериментите in vitro са важни за началната (транслационна) стъпка за изследванията на човешката биология, но не и за по-нататъшен анализ на ролята на молекулата, която представлява интерес в концепцията за човешка атеросклероза, особено взаимодействието на клетките и влиянието върху възпалителните каскади и пътя в атеросклеротични лезии .

Монако и сътр. Създава важна система за краткосрочно култивиране на клетки, изолирани от човешка атеросклеротична тъкан 15. Използвали сте ензимна смес от колагеназа, еластаза и DNase. Този метод позволява изследване на експерименти с лезии на клетъчни клетки, анализ на път на сигнала и изследвания на генния трансфер с аденовирусни вектори. Но остава неизвестно как ензимната смес влияе върху клетките, т.е. степента на активиране, експресията на повърхностния маркер и др. Освен това е под въпрос дали резултатите от тези експерименти отразяват реалните процеси в атеросклеротичните лезии. В допълнение, първоначалното положение на клетките ще бъде унищожено чрез ензимно смесване и системата за краткосрочно култивиране има същите ограничения като при експериментите in vitro с клетки.

За специфични изследвания на клетки или клетъчни популации в рамките на атеросклеротична лезия е възможно да се използва методът за микродисекция с лазерно улавяне. Клетката или клетъчното съединение от интерес ще бъдат изрязани от тъканта с помощта на инфрачервен или UV лазер и може да се извърши анализ на РНК, ДНК или протеин. Изглежда, че лазерната микродисекция не уврежда клетките, експресията на рецептора на клетъчната повърхност и др. Предимството на метода е анализ на клетка или място от интерес в рамките на атеросклеротична лезия. Но не е възможно да се извърши допълнителна оценка на клетките като in vitro проучвания.

Моделът ex vivo се основава на проби от ендартеректомия. Използването на атеросклеротични плаки, получени от различни индивиди, може да доведе до по-голяма степен на диференциален клетъчен състав и следователно до по-големи вариации в нивата на гени/протеини от интерес. Поради това е важно да се използват нефибросклеротични лезии 10 богати на липиди или сложни плакови проби, тъй като възпалителният отговор е значително по-нисък при фибросклеротични лезии. Поради това е от голям интерес да се оцени морфологията на плаката преди да се анализират резултатите от експериментите с култура на плаки.

В допълнение, всеки образец съдържа различни етапи на развитие/прогресия на атеросклеротичните лезии от първоначалната ендотелна дисфункция и стъпка на натрупване на липиди до мастни ивици и развитие на некротично ядро ​​за разрушаване на плаките. По този начин, за да се сведе до минимум хетерогенността на плаковите тъкани, е необходимо да се намалят границите, които обикновено представляват ранни етапи на атерогенезата.

Не може да се изключи, че рязането предизвиква нараняване на тъканите. Но нашите експерименти с тъканна култура на плака показват сравнима генна експресия на култивираната тъканна плака с некултивираната тъканна плака. Така че това подчертава, че настоящият метод е добър инструмент за изследване на възпалителната среда при атеросклеротични лезии.

Парчетата KulturPlaque са ограничени до период до един ден. Ако тъканната плака се култивира повече от един ден, варирането в резултатите се увеличава драстично. Освен това, след 3 дни съставът и морфологията на плаката се сриват.

Има ограничения, които трябва да се имат предвид при прилагането на този модел. Моделът ex vivo е добър метод за изследване на възпалителната среда при атеросклеротични лезии. И все пак, важни компоненти в този контекст липсват. Не са приложими никакви хемодинамични свойства и системните влияния напълно липсват. Освен това, с този метод е възможно да се изследват само краткосрочни промени, но липсва дългосрочен анализ поради разграждането на морфологията на плаката.

В заключение представяме тук метод, който ще бъде полезен за изследователи, които търсят изследване на потенциални нови молекули върху възпаление на атеросклеротична лезия при човека. Моделът за култивиране на плака ex vivo не страда от разлики между мишата и човешката имунна система, но ни дава възможност да анализираме клетъчното взаимодействие в контекста на атеросклеротични лезии и предоставя възможност за изследване на локални възпалителни каскади и лезионови пътища. Методът за култивиране на плака ex vivo, описан тук, е лесен за използване и е възпроизводим и може да помогне за идентифициране и валидиране на нови болестни механизми и терапевтични цели.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Разкриване

Авторите не трябва да разкриват конфликти.