Бърза адаптация към наличието на храна чрез допамин-медииран морфогенетичен отговор
субекти
абстрактно
Въведение
Взаимодействията хищник и плячка могат да доведат до развитие и морфологични реакции със значителни екологични и еволюционни ефекти 1, 2, 3, 4, 5. Защитите, задействани от хищници, намаляват риска от консумация на плячката, докато престъпленията, предизвикани от хищници, подобряват потреблението или конкурентоспособността на хищниците 1, 2, 3, 6, 7, 8. По този начин тези фенотипни промени могат да повлияят на трофичните взаимодействия, динамиката на популацията на хищници и плячки и динамиката на общността и да насърчат видообразуването 1, 2, 6. Необходимо е механистично разбиране на тези реакции, за да се разбере тяхната еволюция, ограничения, адаптивна стойност и функционални последици. 12 .
За да се разграничи дали дългите ръце се индуцират при ниска плътност на храната или, обратно, дали късите рамена се индуцират при висока плътност на храната, е необходимо да се определи основният механизъм за реакцията към храната. С ларвите на Strongylocentrotus purpuratus преди хранене, тази реакция на развитие настъпва в рамките на няколко дни и изисква директно химиосензиране на водораслите 15; Следователно е вероятно да се случи чрез невросензорния механизъм. Ние съобщаваме, че допаминът е неврологичният сигнален път, през който усещането за водорасли променя развитието. Допаминовата сигнализация насърчава съкращаването на дължината на ларвения ръкав от максимума за развитие. Следователно, неочаквано тази предизвикана от плячка пластичност не е обиден отговор за подобряване на снабдяването с ресурси. Чрез експериментална манипулация на допаминовите сигнали и дължината на рамото, ние оценяваме разходите, ползите и ограниченията на този фенотипен отговор и предоставяме доказателства, че ларвите на морски таралежи може да са избрали широко използван път за хранене за отговори на развитието.
Резултати
Индуцираният от водорасли допаминов сигнал инхибира удължаването на рамото
Диференциални контрастни изображения на ларви в края на периода преди хранене, ден 5, култивирани без ( а ) и със ( б ) Водорасли, започващи в стадия на гаструла. Дължините на скелетните елементи след поглъщане и тялото са обозначени с черните линии. Количествено определяне на ( ° С ) дължина на посторалната ръка, която представлява промяна от 20,2% (± 3,9%), и ( д Дължина на пръчката на тялото, което представлява промяна от 3,9% (± 1,5%) за ларви, които са били култивирани с (зелени, n = 20) и без (сини, n = 18) водорасли. Ученически двустранен t-тест, *** P
( а ) Промяна в дължината на посторалното рамо и тяло при 5-дневни ларви, третирани с DRD2 агонист квинпирол при посочените концентрации в сравнение с контролата. Еднократна ANOVA за посторална дължина на рамото, F 3.463 = 30.586, P
( а ) Промяна в посторалната дължина на рамото и тялото на 4-дневни ларви, които са култивирани със или без водорасли като контрола (синьо) и транслационно блокиращо MASO при 0,4 mM (TH MASO1, светло сиво) лечения. ANOVA (допълнителна таблица S2), лечение × водорасли за посторални ръце, F 1.286 = 19, 604, P 18 (допълнителна фигура S2) и удължават процесите по дължината на цилиарния лигамент (фиг. 4д), които могат да участват в усещането за водорасли. Тези данни са съгласни с разпределението на допамин-положителните клетки в ларвите на S. droebachiensis 19 и с невросензорна функция. По-голямото увеличение (× 40) на ембриони, двойно оцветени за допамин и PMC маркер, показва, че допамин положителните клетки са непосредствено в непосредствена близост до PMCs (4g-j). Въпреки че вторичният ендокринен сигнал 9 често е невростимулиран при пластични фенотипни отговори, близостта на допамин-положителни клетки до PMCs и прилежащата ектодерма в посторалните рамена увеличава възможността допаминът да сигнализира директно към един или и двата клетъчни типа, за да инхибира растежа на ръката.
Флуоресцентно имунохистохимично откриване на ограничаващия скоростта ензим за биосинтез на допамин TH и PMC маркер (SM30) като референтен, 54 h след оплождането (hpf) ( а ) и 60 к.с. ( б ). Белите стрелки в тези и следващите полета показват върха на посторалната ръка. ( ° С ) Дължина на посторалната ръка в сравнение с hpf, която показва едновременното начало на удължаване на рамото и първото откриване на TH-положителни клетки (черна стрелка). Сивата пунктирана линия показва приблизителната дължина на първоначалното триизлъчване. Лента на грешки ± sem Флуоресцентно имунохистохимично откриване на допамин ( д ) и TH ( д ) и маркери PMC, Msp130 ( д ) и SM30 ( д ), в фазата на плюте (92 к.с.). Флуоресцентна in situ пълна хибридизация за откриване на ddc иРНК ( е ) в посторалния връх на ръката и в серотонинергичните ганглии (горе на снимката) на ранния плутеус (72 hpf, орален изглед). ( g - j ) Изображения с по-голямо увеличение на имунните петна от допамин и PMC (Msp130) на върха на ръката. Ядра, оцветени с DAPI (синьо). DA, допамин DC, допа декарбоксилаза. Мащабна лента ( а - е ) 50 μm, ( g - j ) 10 μm.
Експерименти за регулиране на гените надолу (фиг. 3) и за разрушаване на лекарствата (фиг. 2 и 3), които са насочени към две независими точки в сигналния път, както и времевите и пространствените модели на експресия на допамин и допаминовите биосинтетични ензими (фиг. 4) идентифицирайте допамина като ключов сигнал, медииращ фенотипния отговор на наличието на храна. Без допаминов сигнал пластичността се губи на една ръка разстояние. По този начин посоката на фенотипната пластичност е ясна: Късите рамена се индуцират във висока плътност на храната, когато допаминовите сигнали инхибират скелетното разтягане и по този начин насърчават структурния растеж.
Последици от поглъщането и съхраняването на майчините липиди
Показвайки, че участието на допаминовата сигнализация е насочено към намаляване на размера на хранителните рамена, ние също сме били в състояние изкуствено да манипулираме размера на хранителната структура, за да определим адаптивния капацитет. Тествахме функционалните последици за храненето и консумацията на енергия от фармацевтично различни размери на устройствата за хранене. Този метод е изгоден при различна концентрация на водорасли, тъй като ларвите на морски таралеж могат да съдържат екзогенно разтворен органичен материал 20, 21, който може да промени метаболитното си състояние, въпреки че все още не са хранени.
Предишни проучвания показват, че размерът на апарата за хранене корелира добре с максималната скорост на изчистване на храната за времето на развитие 13, 22 и между различните видове 23 от ларви на ехинодерми. Разликите в размера между видовете или етапите на развитие (напр. 4-раменни срещу 8-раменни Echinoplutei) са по-големи, отколкото сме наблюдавали тук в един етап на развитие при един вид. За да определим дали относително малките промени в структурата на хранене биха могли да повлияят значително на скоростта на улавяне на водораслите, ние фармацевтично манипулирахме размера на хранителната структура и след това позволихме на ларвите да се хранят със суспензия от миметици на водорасли. Вариацията в дължината на посторалната ръка значително корелира с P
( а ) Регресия на скоростта на изчистване на дължината на посторалната ръка след 5 дни при многократни опити (кръгове, триъгълници и диаманти) при 1500 перли на мл. И двете променливи бяха нормализирани спрямо наблюдаваните максимуми. Сборна регресия на Модел I, R 2 = 0, 197, β 1 = 0, 866, P 2 = 0, 877, β 1 = 0, 287 ± 0, 14 (95% CI), n = 6-та лента за грешка ± sem
дискусия
Реакцията на хранене на ларвите на морски таралежи, както и много други характеристики, предизвикани от плячка, се смята за обидна и увеличава храната на хищници 2, 15. За разлика от това, нашите данни показват, че молекулярният механизъм всъщност намалява размера на хранителната структура, когато се открият водорасли. Индуцираната от водорасли допаминова сигнализация потиска стандартната програма за развитие, използвана при предварително хранене на ларви, за да се получат по-къси рамена с по-нисък потенциал за хранене.
За да се запази фенотипната пластичност, фенотипните промени трябва да максимизират пригодността за дадената среда. Ние показваме, че дългоръкият фенотип максимизира фитнес, когато храната е оскъдна, чрез увеличаване на потенциала за придобиване на храна за сметка на майчините липиди. Докато късоръкият фенотип максимизира фитнеса, когато храната е в изобилие, като запазва липидите на майките за сметка на максималния потенциал за снабдяване с храна. Възможно е да има допълнителни компромиси във фитнеса, например между дължината на ръката и размера на стомаха 26 и/или производителността на плуване 27, които са свързани с този отговор на развитието.
Възможността за приписване на запасите от майчина енергия за други цели може да има значителни последици за оцеляването и успеха в изпълнението в няколко фази от живота чрез латентни ефекти 28, 29, 30. Например, чрез увеличаване на разпределението им за развитие на младежите, ларвите могат да съкратят времето, през което са изложени на хищници в планктона, или качеството на освободените младежи 29, 30 може да се увеличи. Тъй като S. purpuratus има висок процент на смъртност след заселване с редки успешни събития за набиране 31, 32, състоянието по време на заселването може да бъде важен фактор, контролиращ динамиката на популациите от бентосни морски таралежи, което има последици на ниво общност 33, 34. Тъй като честотата или тежестта на несъответствията на честотата на ларвите и наличността на храна се увеличава, намаляването на честотата на водораслите по време на фазата на предварително хранене води до повишена честота на дългоръки ларви и загуба на каквито и да било ползи от ларвите с къси ръце, като преразпределение на запасите от майчина енергия.
Нашите данни демонстрират адаптивното използване на допаминовите сигнали за бързо изменение на развитието на фуражните структури в очакване на храна. Само чрез механистично разбиране тази промяна, предизвикана от плячка, може да бъде поставена в съответния екологичен и еволюционен контекст. Различни организми, от червеи до хора, използват допаминовата сигнализация 35, 36 чрез допаминови рецептори тип D 2, по-специално 37, 38, за да предвидят консумацията на храна. В C. elegans 35, 38, насекоми 39, 40, възрастни морски таралежи 41 и бозайници, включително хора 36, допаминовият сигнал променя поведението в очакване на поглъщане, докато ларвите на морски таралежи променят своето развитие и форма преди поглъщането. По този начин допаминовата сигнализация, която участва в регулирането на развитието на ларвите, може да представлява коопция или преминаване от силно консервираното използване на допаминовата сигнализация при медииране на поведението в очакване на храна.
Методи
Култура на ембрион и ларва
Възрастни морски таралежи, Strongylocentrotus purpuratus от Cultured Abalone и Point Loma Marine Invertebrate Lab, CalTech, се поддържат в морска вода при 10 ° C. Гаметите се събират чрез интракоеломични инжекции от 0,55 М KCl. Ембрионите се култивират по стандартни методи при плътност от 1-5 ембриони на ml в изкуствена морска вода (ASW) при 15 ° C с или без водорасли (5000 клетки на ml Dunaliella sp.) .
Количествено определяне на дължините на скелета
Дължините на посторалната ръка и тялото (всеки n ≥ 20) са определени от произволна проба, която е взета непосредствено преди началото на храненето на 5 дни pf, с изключение на ембриони, които са били инжектирани с морфолино и които са взети след 4 дни pf, за да се гарантира, че това морфолино разграждане на синтеза на протеин TH е все още ефективно. За да се разположат скелетните елементи в една и съща равнина, ларвите се изстискват върху предметни стъкла на микроскопа и след това се изобразяват с обърнат микроскоп Zeiss Axiovert 200 M при 20 × при контраст на диференциално заключение, при което двупреломлящите скелетни елементи могат лесно да бъдат идентифицирани. Дължините на скелета се определят количествено от цифровите изображения със софтуера AxioVision (Carl Zeiss MicroImaging). В някои случаи (42, амисулприд, силно селективен D 2/D 3 антагонист на допаминовия рецептор 43 и α-метил-DL-тирозин метилов естер хидрохлорид, селективен инхибитор, нарушен от TH 44, директно чрез разреждане в хранителната среда (ASW), прилаган на пълни ларви на братя и сестри в късния стадий на гаструла (48-52 к.с.), освен ако в текста не е посочено друго. Фармацевтични експерименти са проведени в два екземпляра с различни двойки жена-мъж.
Микроинжекции
Оплодените яйца се инкубират с филтрирани разтвори, съдържащи 20% глицерин и родамин-декстран без морфолино (контрол на глицерина) с 0,4 mM TH MASO1 или с 0,15 mM TH MASO2 с помощта на микроманипулатор Eppendorf Femtojet-Injectman NI2, който е беше свързан инвертиран флуоресцентен микроскоп Leica, микроинжектиран в (Ref. 45). Инжекциите TH MASO1 бяха реплицирани с две различни двойки жени-мъже. Глицеролът и неинжектираните ембриони се сравняват и не се забелязват значителни промени в дължината на скелета, TH имунооцветяване или отговор на водорасли. Следователно някои по-късни експерименти използват неинжектирани ембриони като контроли. Блокиращият превод TH MASO1 е разработен въз основа на предсказания TH (GLEAN 00836) 5'UTR, което е потвърдено от RACE. TH MASO1: 5'-GCGTCCTGCTGTAGAAGATACTTGA-3 '. TH MASO2 насочва границата на интрон 8/екзон 9, за да наруши каталитичния домейн на ензима 46. TH MASO2: 5'-GCCTACGATGAACAAGAACAAATGT-3 '.
Статистически анализи за нарушения на допамина
Дозовият отговор на посторалната дължина на рамото към лечение с квинпирол се оценява с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от коригирани с Bonferroni сдвоени сравнения с контролата, за да се определи дали промяната е значима от контролата. Отговорът към водораслите се оценява при фармацевтични и TH MASO1 разстройства чрез трипътен ANOVA, при който лечението на разстройства, лечението на водорасли (с в сравнение с без водорасли) и експерименталната репликация са определени ефекти и средната квадратна грешка като знаменател на f-съотношението . Тъй като всички експерименти показват значително (P> 0,05) взаимодействие между нарушение и лечение на водорасли за посторална дължина на рамото, бяха извършени последващи сравнения, коригирани по Bonferroni по двойки, за да се определи дали индуцираната от водораслита промяна е значителна. TH MASO2 не беше репликиран и така оценен с помощта на двустранните t-тестове на Student. Всички статистически оценки бяха извършени в SYSTAT v10 с изход до три знака след десетичната запетая, поради което са посочени точни P стойности за P> 0,001.
Имунооцветяване и флуоресценция in situ хибридизация
Опит за хранене
Ние третирахме ларви на полубратя от три женски с ASW (контрол), DRD2 агонист (квинпирол) и DRD2 антагонист (амисулприд), за да увеличим максималния обхват на хранителните структури. Ларвите от всяка от тези обработки се комбинират в три повторни култури, прехвърлят се в ASW за 4 часа и след това се обработват с леко разбъркана суспензия от имитиращи водорасли, 10 µm. m Polybead Microspheres (Polysciences, Inc), покрити с BSA при 1500 или 4000, подадени зърна на ml, в продължение на 45 минути. Броят на подбраните перли и дължините на скелета са измерени за поне 30 ларви от всяка реплика, както по-горе. Нямаше значителна разлика между репликирани проби, хранени с 1500 топчета на ml (двуфакторен ANOVA, двустранен P = 0.950, SYSTAT v.10), така че репликите бяха обединени и анализирани, използвайки регресия на Модел I.
Липидни анализи
Дублирани култури, всяка от които се състои от полубратя и сестри от три женски животни, се отглеждат в внимателно разбъркани 500 ml бехери в инкубатор при 15 ° С. В началото на удължаването на ръката (
Нормализираните средни стойности на посторалната ръка и стойностите на триглицеридите бяха изчислени, като се използва Model II Geometric Mean Regression 52, за да се отчете грешката, свързана с двете променливи. Дължината на посторалната ръка беше нормализирана до максимум. Концентрацията на триглицеридите се нормализира до първоначалната концентрация в оплодени яйца (ден 0, преди разцепване). Леченията в реплицирана култура са имали същите начални концентрации на триглицериди, което позволява директни сравнения между леченията. Тъй като не е имало взаимодействие с култури (двуфакторен ANOVA, двустранен P = 0,478, SYSTAT v.10), двете култури са обединени за регресия.
Още информация
PDF файлове
Още информация
Допълнителни фигури S1-S4 и допълнителни таблици S1-S3
Забележки
Изпращайки коментар, вие се съгласявате с нашите условия за използване и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, маркирайте го като неподходящо.