Биохимия за пречистване на протеини

Пречистването на протеин е процес, който отнема няколко стъпки: първоначална екстракция, диференциално утаяване, диализа, хроматография от различен тип и т.н.

могат бъдат

ТЕОРЕТИЧНИ ПРИНЦИПИ

Основни етапи на пречистване

Обикновено първо смачкваме материала, от който искаме да извлечем протеина (животинска тъкан, част от растения, бактерии и т.н.). За тази цел могат да се използват различни устройства ("Waring Blender", Potter-Eveljhem устройство, "Polytron" и др.). Тази хомогенизация се извършва в буфер с подходящ състав. Тази стъпка очевидно е първата.

След това се използват различни техники за отделяне на желания протеин от всички останали присъстващи. Обикновено първите стъпки не са много специфични техники, но са подходящи за обработка на големи обеми. След това, докато стъпките продължават, се използват все по-специфични техники, които често са приложими за препарати с намален обем.

Един от най-подходящите методи за големи обеми е диференциалното утаяване на амониев сулфат. Ето защо много често се използва веднага след хомогенизиране, за да се отърве по-голямата част от замърсителите.

Йонообменната хроматография или афинитетна хроматография, приложими за добри обеми на пробата, но притежаващи доста добра разделителна сила, са добри междинни методи.

И накрая, често се използва молекулярно пресяване или изофокусиране, което позволява пречистване на чистотата, но изисква много малки количества концентриран протеин.

Често между тези стъпки е необходимо да се отстранят солите или продуктите, използвани в тези хроматографии. След това се използва диализа или ултрафилтрация. Ако трябва да концентрираме препарата, той е лиофилизиран. Ако някой иска да избегне тези процедури, трябва да избере методи, които не се влияят неблагоприятно от тези продукти.

Протеинов анализ и анализ на протеинова активност

Всички тези стъпки трябва да се следват отблизо, за да се провери дали техниките работят добре. За това е много често да се измерва протеинът, който трябва да се пречисти след всяка стъпка. Следователно е необходимо да има метод за анализ (ензимен, имунологичен, биологичен и др.), За да се следва процесът. Измерваме и общото количество протеин. Тази последна стойност ще се използва за изчисляване на специфичната активност (виж таблицата за пречистване)

В случай, че това е първият път, когато протеинът е изолиран, ще е необходимо да се разработи методът за анализ, преди дори да се разработи методът за пречистване.

Таблица за пречистване и критерии за чистота

По време на всички тези стъпки е от съществено значение да се оценят двата ключови фактора, чистота и добив. Добивът (количеството получен протеин) може лесно да бъде измерен чрез ензимен анализ, RIA и др. Таблица за пречистване (виж раздел "изчисления") също е много полезен инструмент за тази цел. Ако се установи, че един от етапите на пречистване причинява значителна загуба на активност или количество на протеина, трябва да се постави под въпрос неговата полезност или качеството на неговите характеристики. Специфичната активност е количествена мярка за чистотата на препарата. Тук отново, ако забележим, че една стъпка не позволява увеличаване на чистотата, тогава трябва да поставим под въпрос нейната значимост. За да можете да изчислите добива и пречистването, не забравяйте да измерите общия обем на получената фракция след всяка стъпка и да вземете проби от нея, които ще позволят определянето на общите протеини и количеството на протеина qu 'ние опитайте се да изолирате.

Чистотата на протеинов препарат също може да бъде оценена според качествените критерии. По този начин той може лесно да бъде визуализиран качествено чрез електрофореза с висока разделителна способност или изоелектрично фокусиране. Ако се види само една протеинова лента, може да се заключи, че препаратът съдържа само един протеин. Тази качествена оценка обаче може да бъде изкривена, ако протеинът е замърсен от един или повече други със същата подвижност при условията на електрофореза или фокусиране. Тези техники също позволяват да се проследи пречистването и да се види дали броят на замърсяващите протеини намалява с напредването на процеса, за да завърши, в идеалния случай, с един вид протеин.

МЕТОДОЛОГИЯ И АПАРАТ

По време на всички тези стъпки очевидно е необходимо да се избягва денатурирането на протеина, който искате да изолирате. Следователно е необходимо да се използват среди, чиито характеристики са съвместими със стабилността на протеините (рН, йонна сила, осмоларност, соли, антиоксиданти и др.). За това се произвеждат някои повече или по-малко „физиологични“ среди, като PBS или физиологичен разтвор, които имат някои от тези свойства. По този начин физиологичният разтвор (150 mM NaCl или 0,85%) има почти физиологична осмоларност от 300 mOs. Често се използва буфер за поддържане на рН (обикновено около 7,4). PBS ("фосфатно буфериран физиологичен разтвор") съдържа фосфатен буфер рН 7,4 и осмоларността на сумата от всички негови компоненти е 315 mOs. Физиологичните среди са разгледани в раздела "физиологични разтвори" на SIITUB.

За да се поддържа рН на адекватно ниво, в разтворите обикновено се включва буферен продукт. Фосфатът (като моно- и двуосновна смес) се използва в PBS. Трис (трихидрокси-метил-аминометан) се използва много често поради ниската си цена, дори ако не е много ефективен при pH 7.4 и инхибира определени физиологични реакции. Често се използва и хепес (хидроксиетил-пиперазин-етан-сулфат). Качествата и дефектите на основните продукти, използвани за буфериране на pH във физиологични разтвори, са разгледани в раздела "pHmetry" на SIITUB.

Също така трябва да избягвате денатурирането на протеини, като ги излагате на въздух или като ги разпенвате, което причинява денатурация и насърчава окисляването. Това е особено случаят с окисляването на тиоловата функция на цистеините до цистини, т.е. образуването на дисулфидна връзка. Цитоплазмените протеини са особено чувствителни, тъй като естествената им среда, цитозолът, леко намалява. Следователно те не издържат на тяхното разтваряне в околната среда, която се окислява. За защита на тези протеини често се препоръчва използването на антиоксиданти като β -меркапто-етанол или един от реагентите на Cleland, дитиотреитол или дитиотретреол. Протеините на извънклетъчните отделения (кръв, цереброспинална течност и др.) Са много по-малко податливи на този проблем, тъй като те са леко окисляващи среди. Протеините в тези отделения не съдържат или са много малко свободни тиоли, а по-скоро дисулфидни връзки.