Aspergillus niger при отомикоза Кои са мъжете в черно в отомикоза PDF Безплатно изтегляне
Теза Aspergillus niger при отомикоза Кои са мъжете в черно при отомикоза? подадено от Marcel Schöpfer Mat.Nr .: 0412267 за придобиване на академична степен на доктор по медицина (Dr.med.univ.) в Медицинския университет в Грац Изпитващ: ас. Прив.-Доз. Инж. Маг. Д-р Уолтър Бузина, Институт по хигиена, микробиология и медицина на околната среда Унив. Професор доктор. Дорис Ланг-Лойдолт, Университетска клиника за УНГ Грац Грац, юли 2011 г.
Декларация за чест Декларирам в чест, че сам съм подготвил тази научна работа и че сам съм извършвал дейностите, пряко свързани с нея. Също така декларирам, че не съм използвал никакви помощни средства, освен посочените. Наблюдавах всички авторски и договорни права на използваните литературни източници, използвах само посочените източници и маркирах дословно взетите пасажи или по отношение на съдържанието от използваните като такива източници. Подкрепата, предоставяна по време на работния процес, включително важни напътствия, е посочена изцяло. Тази дипломна работа е представена в печатна и електронна форма и все още не е изпратена на нито един друг изпитен орган. Грац, юли 2011 г. (Марсел Шьопфер)
Благодарности Бих искал да благодаря на всички, които ми помогнаха да свърша тази работа: Института по хигиена, микробиология и медицина на околната среда и Университетските клиники по медицина на ушите, носа и гърлото в Грац и Инсбрук за осигуряването на необходимото оборудване и материали. Ас.-Проф. Прив.-Доз. Инж. Маг. Д-р Валтер Бузина и Унив.-проф. Д-р Дорис Ланг-Лойдолт за научния надзор. Всички колеги, особено Bettina Heiling, за практическата им подкрепа. Маг. Петър Чуфер за корекция на тази работа. На брат ми Патрик за графичната и техническа помощ. Моите любящи родители, Вернер и Елфриде, за придружаването и подкрепата на пациента по време на изучаването на хуманната медицина и за осигуряването на важен и незаменим етап в живота. На моя кръстник д-р. Хелмут Шьопфер, без когото никога не бих учил медицина.
Съдържание 1. Въведение. 1 1.1 История. 1 1.2 Какво представляват отомикозите. 4 1.3 Анатомия и хистология на външния слухов проход. 6 1.4 Биология на гъбите. 9 1.4.1 Класификация и номенклатура. 9 1.4.2 Система D-H-S: класификация на медицински важни гъби. 11 1.4.3 Структура на гъбната клетка. 12 1.4.4 Физиология. 14 1.4.5 Условия на живот и начин на живот на медицински важни гъби. 15 1.4.6 Микопатии. 17 1.5 Цел на работата. 18 2. Материал и методи. 20 2.1 Работни стъпки. 20 2.2 Примерни материали. 20 2.3 Културни среди. 21 2.4 Молекулярна биологична идентификация. 21 2.4.1 Изолация на ДНК. 22 2.4.2 PCR. 22 2.4.3 ДНК секвениране. 25 2.4.4 Анализ на последователността и база данни. 26 3. Резултати. 27 3.1 Морфология. 27 3.2 Молекулярни биологични резултати. 31 3.2.1 Изолация на ДНК и PCR. 32 3.2.2 ДНК секвениране. 33 3.3 Медицински досиета. 57 3.4 Статистическа оценка на демографските данни на всички положителни гъбични находки от ухото (2006-2010). 63 4. Дискусия. 67 4.1 Биологична дискусия. 67 4.2 Клинична дискусия. 69 5. Обобщение. 74 6. Резюме. 76 7. Литература. 77 Приложение. 81
Съкращения A. d. Aqua destillata, дестилирана вода bp двойка основа ddntp дидеоксинуклеотид трифосфат dntp дезоксинуклеотид трифосфат ДНК Дезоксирибонуклеинова киселина, дезоксирибонуклеинова киселина EDTA етилендиаминтетраоцетна киселина Eppi 1,5 ml реакционен съд EtBr етидиев бромид мин центробежна сила RT стайна температура от A. Aspergillus Taq Thermus aquaticus GG канал на дясното ухо. дясно ляво лява РНК рибонуклеинова киселина bt2a/b тубулинов грунд o. B. няма открития sp./spp. Видове/Няколко вида
Тимпанична мембрана (Membrana tympanica) Тимпаничната мембрана е жилава кожа между външния слухов канал и тимпаничната кухина с трислойна структура, тя е границата между външното и средното ухо. Aspergillus niger при отомикози 8
2. Материал и методи 2.1 Работни стъпки Организация на работните стъпки, които ще бъдат разгледани по-подробно по-долу: Заявление за комисия по етика с гласуване в приложението УНГ линейка + намазки на външния слухов канал с помощта на тампони Култивиране на цитонамазки върху бактериологични и микологични среди Морфологична идентификация Свръхваксинация Молекулярно биологична идентификация: Изолация на ДНК след 24 часа ITS-PCR TS-секвениране на тубулин за по-прецизно разграничаване между два типа 2.2. Пробни материали Лицата, диагностицирани с ушна инфекция в амбулаторните клиники на УНГ клиниките в Грац и Инсбрук, са имали право на проучване. След като участниците в проучването са били информирани и са дали съгласието си, са взети тампони от външния слухов проход с помощта на тампони (Copan Sterile Transport Swabs). Aspergillus niger при отомикози 20
лени гъби, използвани. Вариацията на некодиращия ITS регион се използва за разграничаване между родове и популации. Първо се приготвя главен микс за PCR реакцията, в който се съдържат всички компоненти (двойка праймери, четирите нуклеотида, буфер и ДНК полимераза) с изключение на ДНК. 18,8 μl от това се пипетира в 0,2 ml вериги на реакционния съд и 1,2 μl ДНК се добавят към всяка. Положителна и отрицателна контрола са включени във всяка партида. За да се разграничи точно между Aspergillus tubingenisis и Aspergillus foetidus, генът на тубулина се амплифицира и секвенира с праймерите bt2a и bt2b. Aspergillus niger при отомикози 23
3. Резултати 3.1 Морфология Културите първо са подложени на макроскопски и микроскопски контрол (Фигури 2-7). От наша страна не може да се направи разграничение. Aspergillus niger при отомикози 27
Фигура 2: Култура на Aspergillus foetidus върху Sabouraud Фигура 3: Aspergillus foetidus микроскопски Aspergillus niger при отомикози 28
Фигура 4: Култура от Aspergillus niger на Sabouraud Фигура 5: Aspergillus niger микроскопски Aspergillus niger при отомикози 29
Фигура 6: Култура на Aspergillus tubingensis върху Sabouraud Фигура 7: Aspergillus tubingensis микроскопски Aspergillus niger при отомикози 30
Не могат да бъдат открити значителни разлики между отделните видове Aspergillus. 3.2 Молекулярно-биологични резултати Тъй като не е имало макроскопски или микроскопски видими разлики между черния Aspergillus, ние се стремим към молекулярно биологична идентификация с помощта на променливия и некодиращ ITS регион на рибозомната ДНК и тубулиновия ген за много гъби. ДНК беше изолирана от нашите гъбички и анализът на последователността започна след PCR. Aspergillus niger при отомикози 31
3.2.1 Изолация на ДНК и PCR Първата контролна стъпка за успешна PCR беше агарозният гел с нашите PCR продукти. Пречистването и секвенирането може да започне с онези проби, чиито ленти се виждат ясно. Фигура 8: Агарозен гел от PCR продукти (ITS), оцветен с EtBr Фигура 9: Агарозен гел от PCR продукти (-Tubulin), оцветен с EtBr Aspergillus niger при отомикози 32
3.2.2 ДНК секвениране ITS регион Като препратка бяха използвани щамовете CBS на Aspergillus niger (CBS 554.65), Aspergillus foetidus (CBS 56465) и Aspergillus tubingensis (CBS 134.48). Aspergillus niger беше разграничен от Aspergillus foetidus и Aspergillus tubingensis въз основа на базовите разлики в G 56 A, C 109 T, C 514 T (подравняване вж. По-долу). Търсеше се диференциация между последните две въз основа на гена, кодиращ тубулин. Aspergillus niger при отомикози 33
3.3 Медицински досиета При 15 пациенти, в допълнение към точната молекулярно биологична идентификация, находките от гъбички са сравнени ретроспективно с клиничните находки. Данните идват от клиничната комуникационна и информационна мрежа MEDOCS. Aspergillus niger при отомикози 57
3.4 Статистическа оценка на демографските данни на всички положителни гъбични находки от ухото (2006-2010) Статистическата оценка на всички положителни гъбични находки от ухото в периода от 2006 до 2010 г. от микологичната лаборатория на Института по хигиена, микробиология и медицина на околната среда показва 425 положителни находки от гъбички от 360 Търпелив. Открити са общо 478 гъбички, което може да се отдаде на повтарящи се случаи на отделни пациенти и наличието на смесени или множество находки. Откритите гъби включват 28 различни вида. При нашия анализ Candida parapsilosis се открива най-често в ушния канал, последван от A. niger sensu lato. (Таблица 6, фигури 10 и 11) Aspergillus niger при отомикози 63
Таблица 6: Гъбичен спектър (2006-2010) Име на зародиш/име на зародиш% въз основа на брой/име на зародиш Candida parapsilosis 139 29,08% Aspergillus niger 97 20,29% Aspergillus fumigatus 85 17,78% Candida albicans 83 17,36% Aspergillus flavus 23 4,81% Pseudallescheria boydii 7 1,46% Candida glabrata 6 1,26% Candida lusitaniae (Clavispora lusitaniae) 4 0,84% Гъби 3 0,63% Scopulariopsis brevicaulis 3 0,63% Aspergillus candidus 3 0,63% Trichophyton mentagrophytes 2 0,42% Candida non-albicans 2 0,42% Candida Gilliermondii (Pichia Gilliermondii) 2 0,42% Aspergillus sclerotiorum 2 0,42% Стерилен мицел 1 0,21% Scopulariopsis sp. 1 0,21% Scedosporium apiospermum 1 0,21% Paecilomyces sp. 1 0,21% Microsporum canis 1 0,21% Exophiala dermatitidis 1 0,21% Chrysosporium queenslandicum 1 0,21% Candida utilis 1 0,21% Candida tropicalis 1 0,21% Candida magnoliae 0,21% Candida famata 1 0,21% Candida ciferrii (Stephanoascus ciferrii) 1 0,21% Aspergillus terreus 1 0,21% Aspergillus sydowii 1 0,21% Aspergillus sp. 1 0,21% Aspergillus oryzae 1 0,21% Aspergillus glaucus 1 0,21% Общо 478 100% Aspergillus niger при отомикози 64
Гъбички на конци (n = 233) vs. Гъби (n = 245) (n = 478) Гъби 49% Гъби 51% Фигура 10: Диаграма на нишковидни vs. Гъби от всички положителни гъбични находки (2006-2010) Нишковидни гъби в проценти (n = 233) 10% 36% 12% 42% Aspergillus niger Aspergillus fumigatus Aspergillus flavus Други Фигура 11: Диаграма на нишковидни гъбички на всички положителни гъбични находки (2006-2010) Aspergillus niger при отомикози 65
Разпределение по пол (n = 360) жени 43% мъже 57% Фигура 12: Разпределение по пол на пациенти с всички положителни находки от гъбички (2006-2010 г.) Пациентите от мъжки пол са по-често срещани с находки от гъбички в ухото. Резултатите обаче не могат да бъдат проследени до диагностицирани отомикози и дават само преглед на гъбичките, открити в ухото през последните пет години. Възрастово разпределение на положителните находки от гъбички в% (n = 360) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 18 18 16 13 13 8 8 3 4 0-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61 -70 71-80> 80 Фигура 13: Разпределение на възрастта на пациентите с всички положителни находки от гъбички (2006-2010 г.) Средната възраст е 52,3 години със средна стойност 52 и стандартно отклонение 19,88 години. Възрастовите групи от 41 до 50-годишни и от 51 до 60-годишни (по 18%) най-често се сблъскват с положителни находки от гъбички. Aspergillus niger при отомикози 66
както при дрождите, присъстваха точно толкова, колкото и единственото присъствие на Aspergillus niger.Накрая бяха проверени гъбичните находки (от ухото) през последните пет години в по-голямата зона на Грац. От 425 положителни находки от гъбички и 360 пациенти открихме тясно мнозинство в полза на дрожди (51%) в сравнение с нишковидни гъби (49%). Преобладаващият изолат сред 28-те различни вида е Candida parapsilosis (29%), вторият по честота и следователно най-често срещаната плесен е Aspergillus niger sensu lato (20%). Средната възраст е 52,3 години (средна стойност: 52) със стандартно отклонение от 19,88 години. Възрастовите групи от 41 до 50-годишни и от 51 до 60-годишни (всяка 18%) се сблъскват най-често с положителни находки от гъбички. Мъжете (57%) се сблъскват с положителен гъбичен резултат по-често, отколкото жените (43%). Aspergillus niger при отомикози 75