Анализ на метаболитния профил на протокола за ембриони от риба зебра (преведен на френски)

Обобщение

Zebrafish представляват мощен модел на гръбначни животни, който е бил недостатъчно използван за метаболитни изследвания. Тук ние описваме бърз начин за измерване на метаболитния профил in vivo на развитието на ребрата данио, който позволява сравнение на различни параметри на митохондриалната функция между генетично или фармакологично манипулирани ембриони, като по този начин увеличава приложимостта на този организъм.

Резюме

Протокол

Част 1: Химично третиране на ембриони от данио

  1. Събиране на ембриони от зебра след оплождане. Инкубирайте при 28,5 ° C в среда E3 в 100 × 15 mm чашки на Петри. Забележка: За хибридизация in situ или оцветяване с червено масло-O се добавя 1-фенил-2-тиокарбамид (PTU) с крайна концентрация от 0,2 тМ, за да се инхибира образуването на пигмент, 1 но не се изисква за анализ на хипокампала.
  2. За фармакологични проучвания, добавете необходимия химикал в крайна концентрация, подходяща за развитието на ембриони на зебра, приблизително 26 часа след оплождането (HPF) с подходяща команда само носител. Забележка: чувствителни към светлина фармакологични инхибитори, ембрионите могат да се оставят да се развият в тъмния фронт при анализ.

Част 2: Директен метаболитен профил с помощта на анализатора Hippocampus XF 24

В края на тестовете се изчисляват средните стойности от порядъка на 10 и 10 химически обработени ембриони.

Част 3: Оцветяване с червено масло

  1. Ембрионите при 50 hpf се дехорионират с помощта на фини форцепси и се фиксират в 4% PFA през нощта при 4 ° C.
  2. Извършва се О-оцветяване с червено масло, както е описано по-горе 2 (вж Фигура 4).

Представителни резултати

Ние се интересуваме от разбирането на ролята на специфични гени върху метаболизма, по-специално скоростта на дишане и метаболизма на липидите. Следователно, ние лекувахме ембриони от див риба зебра от HPF тип 26 месец със специфичен фармакологичен инхибитор на ензима, кодиран от един от тези гени. При 50 hpf, половината от третираните с носител и инхибитори ембриони се анализират, използвайки Seahorse за митохондриална функция, докато другата половина се определя на 4% PFA през нощта при 4 ° C и след това се оцветява за отлагане на липиди с масло-червено-O. Лечението със специфичния ензимен инхибитор доведе до

2 пъти повече базално дишане (фигура 4А), което е свързано с повишено отлагане на липиди, особено в теленцефалона и под пикочния мехур (Фигура 4B, C).

pload/4300/4300fig1highres.jpg "/>Фигура 1. Схематично представяне на химичното третиране на ембриони от риба зебра. Ембрионите от див тип, генетично инженерство или фармакологично преработени зебрани са фон.

профил
Фигура 2. Островна плоча XF24 на място. (А) Четири ямки съдържат ембрионална среда само като контрол на температурата (маркирана с X), а останалите съдържат по един ембрион/ямка. (B) Отблизо на кладенец (C6), показващ ембрион от див тип от 50 hpf, третиран с превозно средство (DMSO), покрит с екранна снимка на островче (стрелка).

Фигура 3. ДишанеПараметри на йони от див тип за ембриони от 50 HPF зебра. (А) За всяко измерване е представена средната стойност на 20-те отделни ембриони. Базално дишане (средно: 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), максимално дишане (средно: 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), капацитет за спасително дишане (средно: 87,7; SD: 72,0; SEM: 16,1). (Б) За всяко измерване е показана средната стойност от 20-те отделни резултата. Базално митохондриално дишане; митохондриално дишане поради обмен на АТФ; отделено митохондриално дишане и немитохондриално дишане. Mt: митохондриални; SRC: Резервна част Дихателна способност; SD: стандартно отклонение, SEM: стандартна грешка на средната стойност. Резултатите са представени в pmoles на консумирания O 2/min/ембрион. Щракнете тук, за да увеличите фигурата .