Анализ на генната експресия в извор на смарагдов пепел (Agrilus planipennis), използвайки количествено реално

Обобщение

Количествената PCR в реално време (qRT-PCR) е ефективно средство за диагностика на нивата на иРНК в различни тъкани на насекомите и етапи на развитие. В този доклад ние демонстрираме използването на qRT-PCR за определяне на нивата на иРНК в различни ларвни тъкани и етапи на развитие на инвазивните видове насекоми, смарагдови пепелници.

Резюме

Изумруденият пепел (EAB, Agrilus planipennis) е екзотичен инвазивен вредител, който е убил милиони пепелни дървета (Fraxinus spp) в Северна Америка. EAB продължава да се разпространява бързо и атакува ясен от различна възраст, от фиданки до дървета. Към днешна дата обаче за EAB съществува много малко или никакво молекулярно познание. Ние се интересуваме от дешифрирането на молекулярната основа на физиологичните процеси в тъканите, които помагат на EAB за успешна колонизация на пепелни дървета. В този доклад ние показваме ефективното използване на количествена PCR в реално време (qRT-PCR) за изследване на нивата на иРНК в различни стадии на ларвна тъкан (включително мастна тъкан и кутикула в средното черво) и различни етапи на развитие (включително 1 St -, 2 Nd -, 3rd Rd, 4-ти instars, препупи и възрастни) от EAB. Като пример, перитрофин ген (тук наречен AP-PERI1) се използва като ген, който представлява интерес, а пример за рибозомен протеин (AP-RP1) се използва като вътрешен контрол. Перитрофините са важни компоненти на перитрофната мембрана/матрикс (PM), която е лигавицата на червата на насекомите. ПМ има различни функции като храносмилане и механична защита на епитела на средното черво.

Протокол

Пълният протокол с различните стъпки, показани на блок-схемата на фигура 1. Отделни етапи от дисекция, екстракция на РНК, синтез на кДНК от първа верига и qRT-PCR са описани по-долу.

II. Извличане на РНК (съгласно протокола на производителя за използване на тризолен реагент)

  1. За да започнете екстракцията на РНК, първо използвайте пластмасови пестици за хомогенизиране на тъканите в Trizol с епруветки от 1,5 ml Eppendorf. След хомогенизиране, общият обем на всяка проба се довежда до 1 ml с реагента Trizol.
  2. За етапите на развитие хомогенизирайте цялото животно в течен азот с пестик и хоросан. След това добавете аликвотна част от хомогената (50 ug) към 1 ml Trizol.

  1. Инкубирайте епруветките с проби с 1 ml Trizol за 15 минути при стайна температура.
  2. След инкубация, добавете 200 μl хлороформ към всяка епруветка. Веднага след добавяне на хлороформ и разклатете епруветките енергично за около 15 секунди. След това задръжте епруветките на стайна температура за още 2-3 минути.
  3. След това пробите се центрофугират при 12 000 х g в продължение на 15 минути при 2 ° С. След центрофугиране РНК е във водната фаза. Обемът на водната фаза трябва да бъде 600 μl, или 60% от общия обем на Trizol.

  1. Внимателно отстранете само водната фаза. Наличието на вещества под водната фаза ще замърси извлечената РНК. След това прехвърлете водната фаза в подходящо етикетирана епруветка Eppendorf от 1,5 ml.
  2. За да се утаи РНК от водната фаза, смесете 0,5 ml изопропилов алкохол във всяка епруветка. Инкубирайте пробите при стайна температура за 10 минути. След инкубация, центрофугирайте при 12 000 х g за 10 минути при 2 ° С.

  1. След центрофугиране изхвърлете супернатантата от епруветките. РНК се образува в гелообразната пелета на дъното на тръбата. Измийте гранулата със 75% етанол, добавяйки поне 1 ml 75% етанол на 1 ml Trizol. Смесете чрез завихряне. След това центрофугирайте при 7500Xg за 5 минути при 2 ° C.

  1. Изхвърлете супернатанта от епруветките. Отново центрофуга в малката центрофуга за маса за 1 минута. Отстранете излишния супернатант от епруветката чрез внимателно пипетиране. Оставете тръбата отворена и оставете гранулата да изсъхне на въздух за 5-10 минути. Внимавайте със сухите пелети, тъй като това значително ще намали разтворимостта му.
  2. След изсушаване на въздуха, гранулата в обработена вода с диетилпирокарбонат или DEPC. Количеството вода, използвано за ресуспендиране на пелетата, зависи от размера на пелетата. Използвайте 50 μl вода, третирана с DEPC, за малки пелети или 100 μl за големи пелети. Оставете гранулата да се разтвори напълно в обработена с DEPC вода, като плъзнете върха на пипетата нагоре и надолу няколко пъти.
  3. След като гранулата се разтвори, поставете пробата при 55 ° C за 10 минути.
  4. След това се измерва концентрацията на всяка РНК проба с Nanodrop спектрофотометър (2 μl от РНК пробата).
  5. Съхранявайте пробите от РНК при -80 ° C до по-нататъшна употреба.

III. Синтез на cDNA от първа верига (съгласно протокола на производителя с комплект за синтез на първа верига SuperScript от Invitrogen.)

Дизайн на праймера и определяне на референтния ген

    Проектирайте грунд с температура на топене (Tm) от 60 ° C и размер на продукта

100 bp.

  • AP-PERI1 се използва като ген от интерес за този експеримент. За по-късен анализ и нормализиране на данните е необходим референтен ген или система за вътрешен контрол. Рибозомният протеин (AP-RP1) се използва като референтен ген за този експеримент.
  • Пригответе 5um работни запаси от праймери, които ще бъдат използвани, включително вашия референтен ген.

    • Изготвяне на стандартите

    1. За да се изчисли ефективността на използваните грундове, трябва да се направят стандарти.
    2. Направете смес от cDNA от различните проби, които се тестват.
    3. Направете 5X серийни разреждания за всяка точка на графиката. Четири разреждания трябва да са достатъчни, но силно препоръчваме пет.
    4. Обемът варира в зависимост от това колко точки и колко технически реплики са използвани. Трябва да е достатъчно да се направи стандарт за всеки ген, който се тества със съответния референтен ген.

    1. Шаблонът за проектиране показва името на пробата за всяка ямка в плаката qRT-PCR. Не забравяйте, че има стандарти за всеки ген и поне две технически реплики на проба.

    Настройте параметрите на колелото

    1. Включете qRT-PCR машината и въведете параметрите на колелото. Параметрите на PCR за този експеримент са както следва:
      Етап 1:
      • 1 цикъл: 95 ° C 3 минути
      Стъпка 2:
      • 40 цикъла: 95 ° C 15 секунди, последвани от 60 ° C 30 секунди
        (По избор: включете следните стъпки за определяне на кривата на топене)
      Стъпка 3:
      • 1 цикъл: 95 ° C 1 мин
      Стъпка 4:
      • 1 цикъл: 55 ° C 1 мин
      Стъпка 5:
      • 81 цикъла: 55 ° C 30 сек

    Поставете плоча за машина CFX96 (BioRad)

    V. Схематично представяне на експеримента

    генната
    Илюстрация 1: Блок-схема, показваща последователността от стъпки за изследване на генната експресия.

    експресия
    Фигура 2: А) Дисекцията на личинка EAB показва средно черво в средата. Б) изолирано средно черво на ларви EAB

    генната
    Фигура 3: А) Средни относителни стойности на експресия (обороти) за перитрофинов ген (AP-PERI1) в различни стадии на ларвна тъкан, включително кутикула (Cu), средно черво (MG) и мастно тяло (FB). ЕАБ специфичен рибозомен протеин (наричан тук, AP-RP1) е използван като вътрешен контрол за нормализиране на данните, получени за гена, който ни интересува, AP-PERI1. Б) Относителна промяна на гънките в AP-PERI1 в тъканите на ларвите. Тъканта на кутикулата показва най-малка експресия и поради това се използва като калибраторна (1Х) проба (Pfaffl, 2001).

    анализ
    Фигура 4: А) Средни относителни стойности на експресия (обороти) за перитрофинов ген (AP-PERI1) в различни етапи на развитие на EAB, включително етапи на ларви (1-ви, 2-ри, 3-ти и 4-ти), препупи (PP) и възрастни (A). Рибозомален протеин, определен от EAB (AP-RP1), беше използван като вътрешен контрол за нормализиране на данните, получени за гена от интерес, AP-PERI1. Б) Относителна промяна на гънките в AP-PERI1 в различните етапи на развитие. PP пробата показва най-ниското ниво на нивото на иРНК и следователно е взета като калибратор (1X проба).

    Количествената PCR в реално време (qRT-PCR) е ефективно средство за диагностициране на нивата на иРНК в различни тъкани на насекоми и етапи на развитие. Освен това, qRT-PCR обикновено е централният инструмент за валидиране на данни, генерирани от анализи на експресия на гени с висока производителност като микрочипове и ново поколение RNA-Seq.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Дискусия

    Стойността на праговите цикли (Ct) за всяка проба се получава в плаката qRT-PCR. За да се получи стандартната крива, стойността на Ct, получена за всяко разреждане, се нанася срещу логаритъма на концентрацията. След това стойностите на Ct за експерименталните проби бяха нанесени върху тази стандартна серия за разреждане на кривата. Целевите количества бяха изчислени от отделни стандартни криви, генерирани за всеки експеримент, т.е. експресия на тъкани и развитие. След това относителните стойности на израза (оборотите) бяха определени чрез разделяне на сумите на целевата последователност от интерес (в случая AP-PERI1) със сумата, получена за системата за вътрешен контрол (AP-RP1). Важно за изчисленията, регистрационните файлове на REV за всеки ген бяха анализирани чрез ANOVA (Variance Analysis), използвайки процедурата PROC MIXED от SAS (SAS Institute Inc. SAS/STAT User Guide, Версия 9.1). Значението на израза се изисква в p Subscription. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Разкриване

    Няма деклариран конфликт на интереси.

    Благодарности

    Признаваме помощта, предоставена от Лурд Делта Арруета Антекера (Катедра по ентомология, Държавен университет в Охайо/OARDC, Wooster, OH) при организирането на експериментите. Благодарим на Dr. Тереза ​​Полша (USDA, Forest Services, NRS) за изпращане на проби от ларви на EAB. Помощ, предоставена от Dr. Luis A Canas и Nuris M Acosta с настройката на микроскопа са оценени. Финансирането на този проект е получено от държавни и федерални фондове, осигурени от Центъра за селскостопански изследвания и развитие в Охайо, Държавния университет в Охайо.