3D хидрогелни скелета за култура на ставните хондроцити и протокол за генериране на хрущял

Протокол

Всички експерименти бяха проведени в съответствие с насоките за човешки субекти на Станфордския университет и одобрения протокол на Съвета за преглед на институциите.

1. Изолация на ставните хондроцити

2. бомиметичен хидрогел Производство

Забележка: Този метод позволява биомиметичен синтез на хидрогел, съдържащ поли (етилен гликол диакрилат) (PEGDA, MW 5000 g/мол), хондроитин сулфат-метакрилат (CS-MA) в DPBS. Добавянето на фотоинициатор позволява фотоактивирано омрежване. Крайният хидрогелен състав съдържа 7% w/v (w/v) PEGDA, 3% w/v CS-MA и 0,05% w/v фотоинициатор.

  1. Синтезирайте CS-MA чрез функционализация на полимера на CS с метакрилатни групи.
    1. Пригответе буфериран разтвор от 50 mM 2-морфолиноетансулфонова киселина (MES) и 0,5 M натриев хлорид (NaCl) чрез разтваряне на 1.952 g MES и 5.84 g NaCl в 200 ml дейонизирана вода (DIH) 2O). Разтворете 5 g натриева сол на хондроитин сулфат в буферирания разтвор.
    2. Добавете 0,532 g (4,62 mmol) N-хидроксисукцинимид (NHS) и 1,777 g (9,24 mmol) (3-диметиламинопропил) карбодиимид хидрохлорид (EDC) 1-етил-3- (NHS: EDC моларно съотношение = 1: 2) към разтвора и се разбърква в продължение на 5 минути.
    3. Към разтвора се добавят 0,765 g (4,62 mmol) 2-аминоетил метакрилат (AEMA) (моларно съотношение на NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) и реакцията се поддържа при стайна температура за 24 h.
    4. Пречиства се сместа чрез диализа срещу дейонизирана вода (diH20) в продължение на 4 дни, като се използва диализна епруветка (12-14 kDa MWCO).
    5. Пречистеният разтвор се филтрира през 0,22 µm филтър и се поставят отворените епруветки, съдържащи разтвора, в ексикатора и O/N вакуум. Уверете се, че всички епруветки са защитени от светлина. Съхранявайте разтворения полимер при -20 ° C далеч от светлина и влага.

3. Капсулиране на клетки

4. Анализи на екстракция на РНК и генна експресия

  1. Аспирирайте внимателно средата и поставете стерилен 1X PBS върху заредената клетка заедно с празните контролни хидрогелове.
  2. С помощта на стерилна шпатула прехвърлете всеки хидрогел в чиста епруветка Eppendorf от 1,5 ml и добавете 250 μl триреагент към всяка епруветка. Следвайте инструкциите на производителя, за да изолирате РНК.
  3. След изолиране на РНК и количествено определяне, използвайте 1 ug от всяка проба и извършете обратна транскрипция в cDNA, като използвате комплекта за обратна транскрипция cDNA с голям капацитет.
  4. Да използвате количествена PCR на TaqMan Arrays Gene Expression за изследване на експресията на вашите гени, които представляват интерес. Нормализирайте нивата на генна експресия в GAPDH.
  5. За PCR условията включват 2 минути инкубация при 50 ° С за инактивиране на предишните ампликони с урацилова ДНК гликозилаза, последвана от 1060; мин. инкубация при 95 ° C за активиране на Taq полимераза. След това извършете четиридесет PCR цикъла, състоящи се от 15 секунди при 95 ° C и 1 минута при 60 ° C.

5. Биохимични анализи

6. Механични тестове

  1. Извършете неограничени тестове за компресия, като използвате тест система Instron 5944, оборудвана с 10 N натоварваща клетка.
    1. След желаните дни in vitro култура, извършете теста за компресия върху скелето клетъчен хидрогел и безклетъчните контролни хидрогелове.
    2. Потопете пробите в баня с PBS при стайна температура и компресирайте със скорост на натоварване от 1%/сек до щам до 15% от физиологичния щам 11.12, известен от хрущялната тъкан при състояние на натоварване, отчетено при 10-20% 13.14.
  2. Създайте напрежението въз основа на кривите на напрежението и го напаснете с помощта на полиномиално уравнение от трети ред. Определете допирателния модул на натиск на уравнението за монтиране на кривата за стойности на напрежение от 15%.

Представителни резултати

Биоактивни хидрогелове, съдържащи PEG и CS групи (Фигура 1) представляват идеална платформа за култура и съзряване на човешки ставни хондроцити 2,3,5,7. Хондроцитите от различни възрасти и болестни състояния могат да бъдат култивирани с описания метод и анализирани, за да се определи техният фенотип, генна експресия и биохимични и механични свойства на генерираната хрущялна тъкан. Три проби от хондроцити, младежки - 6 месеца, 34 години и възрастни - остеоартрити - 74 години, са събрани след 3 седмици култивиране в 3D биомиметични хидрогелове. Анализът на генната експресия на нормални хондроцити, както при младежи, така и при възрастни, показва увеличение на експресията на гените на COL2A1 и COL6A1 хондроцитите. За разлика от тях, болните хондроцити показват драстично намаляване на Col2a1, като същевременно запазват експресията на COL6A1. (фигура 2) показва загуба на хондрогенен фенотип, въпреки че се отглежда в благоприятна биомиметична среда.