11-21% въглехидрати 01% мазнини 0,1 2% протеини

Приложение на мембранни адсорбери и скринингови системи за целенасочена обработка на картофени протеини Thomas Scheper, Alain Graf, S. Beutel, M. Lotz, R. Ulber Leibniz Universität Hannover Callinstr. 3 30167 Хановер, Германия 1

Значението на картофите прибл. 220 вида дивеч и около 2000 вида, познати по света днес Световната реколта е около 300 милиона тона годишно през 2004 г. в ЕС 2,7 милиона ха обработваема площ; Добив 65 милиона тона приблизително 30% нишестени картофи (25-30 различни сорта) Операция на кампанията (картофи на маса от юни до септември; картофи от нишесте от август до януари) 2

Съставките на нишестените картофи 11-21% въглехидрати 01% мазнини 0,1 2% протеини 2% фибри 72% вода аминокиселини, витамини и минерали вода 72% картофи аминокиселини 2% нишесте 20% протеин 2% други съставки 2% фибри 2% 3

Промишлено производство на нишесте (нишесте Emsland) Картофи Измиване на картофи Ренде Декантер Обратна осмоза Нишесте и влакна Високопротеинов вторичен поток Сепаратор (измиване на нишестето) Картофена плодова вода (KFW) Нишесте 4

Добавена стойност на картофения протеин Прибл. 6 милиона тона KFW в Европа вода 94% картофена плодова вода, аминокиселини 2% други компоненти 2% компоненти, чисто аритметично h около 120 000 t картофено протеин нишесте 0,5% протеини 2% състав на KFW протеини: 40% пататин (основен гликопротеин) 50% протеаза Инхибитори (незначителни протеини) 10% протеини с високо молекулно тегло (полифенол оксидази, кинази, фосфорилази) 5

Пататин гликопротеини, състоящи се от 362 аминокиселини (богати на лизин и тирозин) MW = 40-44 kda, pi = 4,5-5,2 (изоформи с различни модели на гликозилиране) Ензимни дейности: активност на липидна трансфераза, активност на липидна ацил хидролаза, активност на естераза, Osborne и Campbell, J. Am. Chem. Soc. 1986, 18, 575 Jacusen and Foote, J. Food Biochem. 1980, 4, 43 6

Група протеазни инхибитори (PI) Хетерогенен клас топлинно стабилни богати на цистеин протеини MW = 4-23 kda; pi = 5,1-9,0 90 Играе роля в защитата на растението срещу вредители и др. Инхибиращ ефект върху серин и цистеин протеаза Насърчаване на чувство за ситост (Протеазен инхибитор II) Възможен антиканцерогенен ефект 7 Kennedy et al., Pharmacol. Тер. 1998, 78, 167-209. Pouvreau et al., J. Agri and Food Chem 2001, 49 (6), 2864 Hill et al., Physiol and Behav. 1990, 48, 241

Използване на картофени протеинови фракции Нутрицевтици Бебешки и специални храни Спортно хранене (Amino Mass) Маркетинг като подтискащ апетита (Satise) Медицинска употреба Лечение на диабет II и рак на кожата

Хранителни вещества с положителен физиологичен ефект Борба срещу болести/профилактика, както и повишаване на производителността/благосъстоянието В сравнение с растежа на общия пазар на храни (1-3% годишно), пазарният обем на хранителни вещества нараства с около 8% годишно (изчислено на световния пазар 12 милиарда евро ) Изисквания: вкус добър, практичен, лесно разбираем ефект, евтин, добре изглеждащ 9

Добавена стойност на картофения протеин KFW Топлинната коагулация на протеините KFW осигурява денатуриран продукт Състояние на техниката Протеинови утаявания 110 C Няма биоактивност Маркетинг като нискокачествен фураж за животни Денатурирана цена на картофения протеин на кг като картофен протеин Храна за говеда: 0,5 до 1 обикновена хранителна добавка: 4 до 6 Vision KFW мембранен адсорбер фракциониран картофен протеин (естествен) изолиране на биоактивни протеинови фракции (естествен) маркетинг като висококачествени функционални съставки прогнозна продажна цена за кг: приблизително 50 10

протеинова смес (протеините се свързват според изоелектричната точка) - -SO - 3 OS- 3 - -SO 3 - OS- 3 - -SO 3 - OS- 3 профил през мембранния размер на порите: около 3,0 µm дебелина на мембраната: 180-200 µm плосък модул (аналитични цели) спирален модул (протеин надолу по веригата) вертикален поток към мембранната повърхност вертикален поток към мембранната повърхност

Разнообразие от лиганди на материал надолу по веригата (катионни c групи, 2+ 2+ антитела, Ni, Cu) Основен материал (мембрана, мъниста) условия надолу по веригата (напр. Електрическо поле) свързваща химия (алдехид, епокси)

целеви протеинов лиганд имуноглобулини rt-pa, rh-gh glyc. протеини стрептавидин His-tag-протеини плазмиди, протеини протеин А антитяло конканавалин А биотин Cu, Ni аптамери

Плоча, поставена от ивици с 8 ямки

Интелигентно скрининг зареждане на проби

катионообменник анионообменник протеин A His-tag антитяло Con A

добавяне на проба върху улавяща мембрана

катионообменник проба 6 анионообменник проба 4 протеин A проба 11 His-tag проба 3 антитяло проба 10 Con A проба 1

01 0,1 02 0,2 03 0,3 04 0,4 05 0,5 06 0,6 07 0,7 08 0,8 09 0,9 10 1,0 11 1,1 12 1,2 катионен обменник анионообменник проба 6 проба 4 протеин А проба 11 проба His-tag 3 проба антитяло 10 Con A проба 1 градиент натриев хлорид

Мащабиращ мембранен адсорбер Лесно увеличаване Различни геометрии и режими на работа Спинови модули (1,9 7,5 cm 2) До 2 mg протеин/cm 2 Sartobind модули (15, 75, 100 cm 2) До 0,8 mg протеин/cm 2 24 Модул Sartobind MultiSep-Module (0,1 80 m 2) До 0,8 mg протеин/cm 2

Разделяне на протеини с помощта на мембранни адсорбери Използване на мембранни модули на анион (Q) и катионообменник (S) (Sartobind 15-100 cm 2) Буфер A Буфер B LC помпа за впръскване LC помпа за смесване на клетка проба мембранен модул UV детектор проводимост фракция колектор 25

Резултати в лабораторен мащаб Q фракция: Пататин S фракция: Minore протеини 2,00 1,0 1,75 100 0,9 100 1,50 80 0,8 80 AU [280 nm] 1,25 1,00 0,75 60 40 елуент в% AU [280 nm] 0,7 0,6 0,5 0,4 60 40 елуент в% 0,50 20 0,3 20 0,25 0 0,2 0 0,00 0 5 10 15 20 25 30 35 Време t в [мин] 0,1 0 5 10 15 20 Време t в [мин] Профил на зареждане и елуиране на модул Q15 Профил на елуиране на модул S15 26

Резултати в лабораторен мащаб Стъпки на процеса Изравняване на мембранния модул с 50 mm NaPP (ph 7) Зареждане с KFW (разредено 1: 5, ph 6.5) Изплакване с 50 mm NaPP (ph 7) Елуиране с 0,5 M разтвор на NaCl Регенерация на мембраната с 1M NaCl разтвор натоварващ обем 0.7 L/m² капацитет на свързване на мембраната S адсорбер: 0.67 mg/cm² Q адсорбер: 0.23 mg/cm² 27

Отделяне на протеини с помощта на мембранен адсорбер SDS-PAGE (Tris-HCL, 18%, оцветяване по Coomassie) Ивица 1: Маркер за молекулно тегло lk Пътека 2: Картофена плодова вода, разредена 1:10 Ивица 3 и 4: Елуираща фракция (0,5 M NaCl, Q 15) Ивица 5: Измиваща фракция 6: Фракция на елуиране (0,5 М NaCl, S 15) 28

Характеризиране на Q фракцията - MALDI-MSMS 29

Характеристика на S фракцията - MALDI-MSMS 4153 7879 7857 Потискащ апетит: SATISE S фракция Инхибитор на Kunitz KI Bowman Birk инхибитор BBI инхибитор на карбоксипептидаза CPI 20305 100 4271 интензитет [%] относително Int 80 60 40 20 4144 3890 4292 8058 10101 20227 S KI BBI CPI 0 подтискащ апетита 5000 10000 15000 20000 25000 маса (m/z) 30

Увеличаване до мащаба на процесите Sartobind модули (15, 75, 100 cm 2) Sartobind MultiSep модули (6600 cm 2) 31

Иновативна мембрана надолу по веригата процес KFW първично избистряне/микрофилтрация твърди вещества (протеини, нишесте, влакна и др.) Мембранна адсорбция депротеинизирана KFW (Q) - мембранна адсорбция 6600cm² (S) мембранна адсорбция 6600cm² депротеинизирана KFW елуат елуат сол разтвор ултра/диафилтрация разтвор на сол/диафилтрат Ретентатна лиофилизация/сушене чрез пулверизиране лиофилизация/сушене чрез пулверизиране инхибитори на пататин протеаза xx.xx.2007 г. 32

Резултати от мащаба на процеса стъпка на процеса V [L] t [min] P [bar] Изравняване 5 32 3,2 20 2,0 (20 mm NaPP, ph 7) KFW зареждане 10 5,6 2,2 (микрофилтрирано, 1: 5 разреден, ph 6.5) Изплакване (20 mm NaPP, ph 7) 10 4.2 2.2 Elution Q модул 7.5 3.0 0.8 (0.5 M NaCl) Elution S модул 6.0 2,3 1,0 (0,5 M NaCl) регенерация на мембраната (1 M NaCl) 5,0 2,0 0,8 Капацитет на свързване на S-адсорбера: 1,00 mg/cm² (малък: 0,67 mg/cm 2), Q адсорбер: 0,37 mg/cm² (малък: 0,23 mg/cm 2) 33

За получаване се използва 1m 2 мембрана (свързването и елуирането на 80% от протеините, съдържащи се в KFW, понастоящем може да бъде постигнато): - 3,7 g пататин - 10 g протеазни инхибитори - това отнема 20-25 минути, увеличение площта на мембраната не води до увеличаване на времето. Използвайте KFW 1: 5 разредени 5 L на 1 m 2 xx.xx.2007 г. 34

Гел и капилярна електрофореза Анализ на продукта Фракции на промиване Фракции на елуиране Au (214 nm) S фракция Q фракция kda 100 85 70 60 50 40 30 KFW Q мембрана S мембрана 25 20 0 5 10 15 20 25 Време на миграция [мин] Анализи на ензимна активност 15 M пататин Тест (липидна ацил хидролаза) за пататин Определяне на активността на инхибитора на протеаза срещу трипсин Анализи на активността на полифенол оксидазата l ität 35 PI

Разрушаващи компоненти: Гликалкалоиди се съдържат главно в картофената кора и микробите 20-2525 mg/100g пресен продукт като токсичен праг Симптоми: възпалено гърло, гадене/повръщане, диария, стомашни и чревни спазми, главоболие, треска, задух, замаяност, загуба на съзнание D-галактоза N D- Глюкоза N HO HO OH L-глюкоза O β O OH OH OH O β OO HO α O CH 3 OH OH L-рамноза α-соланин: MW 868,08 g/mol H 3 C HO HO O L-рамноза α O HO OH OH OO α HO β OO CH 3 OH OH L-рамноза α-хаконин: MW 852,08 g/mol 36 maga; Крит. Rev. Food Sci Nutr 1980; Lee, 12 (4), 371 et al; J Agric Food Chem.2004; 52 (10), 2832

HPLC гликоалкалоиден анализ Картофени протеини (фракция) екстракция с оцетна киселина Пречистване на твърда фаза HPLC анализ Резултат 0,15 Соланин стандартен Chaconin стандартен Картофен протеинов екстракт AU (200 nm m) 0,10 0,05 Chaconin lanin So 000 0,00-0, 05 0 5 10 15 20 25 30 35 време на задържане [мин] Количествено определяне на гликоалкалоиди до 20 ppm, фракциите, получени чрез мембранни адсорбери, не съдържат алкалоид ! 37

Заключение Картофената плодова вода съдържа големи количества биологично ценни протеини Досега протеините са получени денатурирани чрез топлинна коагулация (фураж за говеда) Чрез използване на иновативен мембранен процес, протеините могат да бъдат леко фракционирани и изолирани в биоактивна форма възможен е индустриален мащаб 38

Индустриално производство на нишесте и протеини Картофи Измиване на картофи Ренде Декантер Обратна осмоза Нишесте и влакнести материали KFW Сепаратор (измиване на нишестето) Иновативен мембранен процес Протеиново утаяване 110 C Нишесте фракциониран картофен протеин (естествен) Денатуриран картофен протеин xx.xx.2007 39

Производство на протеини Картофена плодова вода Мембрана надолу по веригата Фракции на биоактивни протеини Фракция на инхибитор на пататин протеаза Ензимни дейности: липидна трансферазна активност липидна ацил хидролазна активност естеразна активност MW = 40-44 44 kda, pi = 4,5-5,2 5,2 xx.xx.2007 41 Инхибиращ ефект върху серин и цистеин протеаза MW = 4-23 kda; pi = 5,1-9,0

Преглед на протеиновите фракции Съдържание на протеин [%] Моларна маса [kda] Пататин ti 38 40 (80) Инхибитор на картофи I (PI-1) 4,5 7,7-7,9 (39) Инхибитор на картофи II (PI-2) 22 10, 2 (21) Инхибитор на картофена аспартилаза протеаза (PAPI) 6 19,9-22 Инхибитор на картофена цистеинил протеаза (PCPI) 12 20,1-22,8 Инхибитор на картофена куниц протеаза (PKPI) 4 20,22 Други инхибитори на сериновата протеаза (OSPI ) 1,5 21-21,8 Инхибитор на картофена карбоксипетидаза (PCPI) 1 4.3 Полифенолоксидази (PPO) няма информация 60; 69 Фосфорилазни изоензими няма информация 180-600 Нишестени синтези няма информация 140 Протеинови кинази няма информация няма информация Лектин 1 65,5 xx.xx.2007 42

Възобновяеми суровини Селскостопански и горски продукти, използвани в нехранителния сектор (особено за производство на биоенергия) Селскостопански остатъци Суроватка (преработка на мляко) Меласа (преработка на захарно цвекло) Картофена плодова вода (производство на нишесте) Ulber; CIT 2005, 77 No4, 363 xx.xx.2007 43

Картофено нишесте Годишно производство в ЕС 9,1 Мио нишестените картофи имат съдържание на нишесте до 21% (картофи за маса около 15%) Ориз около 70-7575%, пшеница 58-64%, царевица 60-70% Нишестето се състои от 20% амилоза и 80% амилопектин Източник: Асоциация на нишестената индустрия xx.xx.2007 44

Използване на нишесте Технически продукти (хартия, лепила, строителни материали, текстил) 50% козметични продукти вече се използват в хранителния сектор xx.xx.2007 г. 46

Група протеазни инхибитори Протеин дял на KFW протеин [%] Моларна маса [kda] Картофен инхибитор I (PI-1) 4,5 7,7-7,9 (39) Картофен инхибитор II (PI-2) 22 10, 2 (21) Инхибитор на картофената аспартилаза протеаза (PAPI) 6 19.9-22 Инхибитор на картофената цистеинил протеаза (PCPI) 12 20.1-22.8 Инхибитор на картофената куниц протеаза (PKPI) 4 20.2 Други инхибитори на сериновата протеаза (OSPI) 15 1,5 21-21,8 Инхибитор на картофена карбоксипетидаза (PCPI) 1 4,3 47

Качество на картофения протеин Високо хранително качество: 120 ограничение: триптофан 100 макс. Резултат от аминокиселини (AAS) 80 чисто растителни 60 висок процент глутамин или g протеин] Anfo [mg/g 40 FAO/WHO стандартен картофен протеин Emsland нишесте 20 0 FAO/WHO препоръка (1990): Корекция на протеиновата смилаемост AAS = AAS x фекално вярно смилаемост Ile Leu Lys Met + Cys Tyr Thr Trp Val Протеин Биологична стойност Смилаемост [%] AAS PDCAAS FAO/WHO/UNU Експертна консултация (1985), Изисквания към енергията и протеините, Технически доклад от серия 724. Световна здравна организация, Женева Говеждо 80 98 0,94 0,92 Яйце 100 98 100 1,00 100 1,00 Серия от доклади 724. Световно краве мляко 91 95 1,00 1,00 Соя 74 95 0,96 0,91 Пшеница 64 91 0,47 0,42 Картофи t 69-100 1,00 - Schaafsma, G. (2000), коригирана смилаемостта на протеините аминокиселинен резултат. Journal of Nutrition 130, 1865-1867 48

Характеризиране на Q групата - MALDI MSMS аминокиселинна последователност: 1 MATTKSFLIL FFMILATTSS TCAKLEEMVT VLSIDGGGIK GIIPAIILEF 51 LEGQLQEVDN NKDARLADYF DVIGGTSTGG LLTAMITTPN ENNRPFAAAK 101 DIVPFYFEHG PHIFNYSGSI LGPMYDGKYL LQVLQEKLGE TRVHQALTEV 151 AISSFDIKTN KPVIFTKSNL AKSPELDAKM YDICYSTAAA PIYFPPHHFV 201 THTSNGARYE FNLVDGAVAT VGDPALLSLS VATRLAQEDP AFSSIKSLDY 251 KQMLLLSLGT GTNSEFDKTY TAEEAAKWGP LRWMLAIQQM TNAASSYMTD 301 YYISTVFQAR HSQNNYLRVQ ENALNGTTTE MDDASEANME LLVQVGETLL 351 KKPVSKDSPE TYEEALKRFA KLLSDRKKLR ANKASH Триптичното храносмилане осигурява пептидни маси, които съответстват на теоретичното храносмилане Ясна идентификация на пататина чрез сравнение на база данни xx.xx.2007 49

Характеризиране на S-фракцията - MALDI-MSMS Интензивност [%] 100 80 60 40 S 75 фракция

4300 Da Kunitz инхибитор (около 20 kda) Карбоксипептидазен инхибитор (около 4300 Da) S 75 фракция

20305 Da 20 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 m/z xx.xx.2007 50

катионообменник анионообменник протеин A His-tag антитяло Con A

добавяне на проба върху улавяща мембрана

катионообменник проба 6 анионообменник проба 4 протеин A проба 11 His-tag проба 3 антитяло проба 10 Con A проба 1

Плоча, поставена от ивици с 8 ямки

Предимства на мембранната технология Висока ефективност на разделяне и капацитет Възможни леки условия на процеса Конвективен трансфер на материал, минимизирано ограничение на дифузията Висока производителност, намалено време за обработка 62