Възможности за използване на технологията PROTEIN MICROARRAY (микрочипове) за анализ на протеиновия състав
Възможности за използване на технологията PROTEIN MICROARRAY (микрочипове) за анализ на протеиновия състав на кръвен серум
Автори: Н.Г. Туманова, М.В. Климушин, В.А. Metelskaya, S.A. Бойцов.
Обобщение
Технологията Microchip е удобен и относително икономичен инструмент за анализ на специфични биомаркери, за да се диагностицират заболявания, да се оцени ефективността на терапията и да се изследват сигналните пътища. За да анализираме протеиновия състав на кръвния серум, тествахме някои видове готови микрочипове, които преди това не се използваха в Русия. Успяхме да открием 2% и 5% от матрицата на чипса, в зависимост от техния вид, без предварително изчерпване на суроватката (отстраняване на протеини на основни фракции). По този начин частичният протеинов състав на кръвния серум може да бъде анализиран с помощта на микрочипове, дори без предварително отстраняване на протеините на основните фракции от него.
Ключови думи: микрочипове; кръвен серум; протеинов състав.
Въведение
Протеиновият микрочип е матрица, съдържаща протеинови молекули или молекули на антитела, предназначена за едновременен анализ на голям брой протеинови компоненти в една проба от всяка биологична течност. Технологията Microchip е удобен и относително икономичен инструмент в сравнение с тандемната масова спектрометрия за анализ на специфични биомаркери с цел диагностика на заболявания, оценка на ефективността на терапията, изследване на сигналните пътища и др.
Първите протеинови микрочипове са разработени в средата на 80-те години, преди развитието на ДНК микрочипове [1], но поради продължителния процес на тяхното усъвършенстване те започват да завладяват областта на приложение в лабораторната практика сравнително наскоро. С развитието на технологиите, които позволяват да се подобри качеството на специфичните антитела срещу различни протеини и да се намалят разходите за тяхното пречистване, по-модерните микрочипове навлизат в нова спирала на развитие и започват да привличат интереса на изследователите като инструмент за сравнително икономичен - времеви анализ на голям брой протеинови маркери в минимални обеми кръвен серум и други биологични среди [2, 3]. Към днешна дата са разработени платформи, които съдържат до 9000 протеина и над 4000 антитела на един предмет. Базираните на антитела микрочипове работят на принципа на Western blot. Важно е избраният продукт да е надежден в експлоатация и, съгласно инструкциите на производителя, да гарантира резултат, който е адекватен на декларираните характеристики. Опитът показва, че това не винаги се случва. Цената на микрочиповете е достатъчно висока, за да сортира продукти от различни производители на сляпо и на случаен принцип, така че информацията за това колко успешни са били определени видове чипове за решаване на конкретни проблеми в реалната лабораторна практика би била полезна за изследователите и би могла да им помогне да спестят своята енергия, време и пари. В момента в руската преса практически няма информация за анализа на протеиновия състав на биологичните среди с помощта на готови микрочипове.
Преди да преминем към решаването на по-фини проблеми, свързани с търсенето на конкретни биомаркери, тествахме някои видове чипове, за да определим най-подходящите за решаване на посочените по-горе проблеми. За да анализираме протеиновия състав на серума, ние избрахме SET 100 Full Moon Biosystems Signaling Explorer Antibody Microarray [4] (оттук нататък SET 100), AST 160 Full Moon Biosystems Signal Transduction Pathway Antibody Microarray (оттук нататък AST 160) (Full Moon Biosystems, САЩ) и PlasmaScan ™ 380 антитяло Microarrays (по-долу PS380) (Arrayit Corporation, САЩ). SET 100 микрочипове съдържат 1358 уникални антитела, участващи в 20 биологични сигнални пътеки в две реплики. AST 160 микрочипове съдържат 165 високоспецифични антитела в шест реплики, характеризиращи пътищата за предаване на сигнала. PS380 съдържа 380 антитела в шест копия на предметно стъкло, което позволява на касетата за хибридизация да анализира едновременно 6 различни проби на един предмет. Известно е, че у нас тези видове чипове не са били използвани. Списъкът с протеини, които трябва да се определят с помощта на микрочипове, се съдържа в съответните GAL файлове, които са достъпни за изтегляне от уебсайта на производителя. Съкращението GAL е получено от началните букви на историческото име на списъка с масиви GenePix. Сега това съкращение се е утвърдило като термин и се използва за всички видове микрочипове.
Материали и методи.
Обработка на кръв.
Няколко доброволци взеха кръв на гладно от кубиталната вена. Кръвният серум се получава чрез кръвно центрофугиране при 1000 g в продължение на 20 минути при 4 ° С. След събиране серумът се центрофугира при 10 000 g в продължение на 15 минути при 4 ° С, след което се разпределя в аликвотни части. Аликвотни части се съхраняват при -25 ° С. Концентрацията на протеин в серума е измерена по метода на Lowry [5], калибрирането е изградено с помощта на човешки серумен албумин (HSA). След това серумът се разрежда с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), готов за употреба (Arrayit, САЩ) до крайна концентрация от 100 μg протеин/100 μl. За това серумът първо се разрежда 2 пъти, след това, като се взема обем, съдържащ 100 μg протеин, обемът на PBS се довежда до 100 μl.
