Въведение в използваните техники; са в биохимията
Антитялото (Ab) е протеин, произведен от имунната система и който може да се свърже със специфична молекула, обикновено протеин, нейния антиген (Ag). Много високата специфичност на разпознаването на Ag от Ab и стабилността на Ag-Ab взаимодействието направи, че техниките, получени от имунологията, са били използвани дори за изследвания, които нямат нищо общо с научните изследвания.
Антителата са протеини от семейството на имуноглобулините (Ig). В тялото има няколко вида Ig (IgA, IgG, IgM и др.). При биохимични приложения ние използваме предимно IgG, антитела, които могат да се свържат с два антигена. Много по-рядко използвани, но притежаващи интересен потенциал за развитие, IgY се произвеждат от птици, включително пилета, и се намират в яйца, елиминирайки нуждата от кръвни проби.
За по-задълбочено обсъждане на структурата на антителата може да се обърне към добър учебник по имунология. Предлага се и просто, но относително пълно представяне на тази информация от Д. Уилкинсън
МЕТОДИ И АПАРАТ
В днешно време антителата обикновено се получават от търговски доставчици. В някои случаи трябва да направите антителата сами, особено ако работите с редки или наскоро открити протеини. Първо, животните трябва да бъдат имунизирани, за да ги накарат да произвеждат антитела срещу протеина, върху който работите. Могат да се получат поликлонални или моноклонални антитела. От този суров препарат често е необходимо да се пристъпи към пречистване на антитялото.
Качеството на приготвянето на антитяло за целите на анализа или идентификацията зависи от два основни фактора, специфичност и авидност (или афинитет). На първо място, антитялото трябва да реагира само срещу протеина, който представлява интерес, за да се избегнат кръстосани реакции с други протеини, които могат да го замърсят, това е спецификата. От друга страна, той трябва да реагира силно с този протеин и да има голям афинитет към него, това е алчността.
Имунизация на животни
Някои видове се използват особено за производството на антитела: зайци, мишки, плъхове, кози, овце и коне. Изборът на животно се основава на различни критерии. Ако трябва да произведете много антисерум, тогава изберете по-голямо животно. обаче големите животни са по-скъпи (покупка, разплод и т.н.) и често са по-лесни за обработка. От друга страна, ако искаме животно, с което лесно да се борави и да се размножава в лаборатория, ще се обърнем към по-малки видове. Малки животни като плъхове или мишки се отглеждат лесно в евтини съоръжения и са лесни за работа. Въпреки това, големи количества кръв не могат да бъдат взети. Поради това често се използват видове с междинни размери, като заек. Количеството антиген, което е на разположение, също е много важен фактор: колкото по-голямо е животното, толкова повече антиген е необходим, за да предизвика полезен имунен отговор.
Така или иначе, важно е да изберете животно, което е филогенетично възможно най-далеч от източника на протеина, с който искате да имунизирате. Всъщност, протеинът е още по-антигенен, тъй като не прилича на протеин, който обикновено присъства във видовете, които човек иска да имунизира. По този начин, ако се желае да се получи антитяло срещу протеин на плъх, често ще бъде за предпочитане да се имунизира кон или коза, а не друг гризач като мишката. Както беше споменато по-горе обаче, ограниченията, присъщи на използването на големи животни, все още могат да насърчат преминаването към по-малко подходящ вид, който е по-лесен за развъждане и обработка. Очевидно е също така, че човек не може да имунизира животно срещу протеин, общ за животни от собствения му вид! Мишките се използват особено за производството на моноклонални антитела.
Антигенът може да се инжектира по няколко начина, важното е антигенът да остане в тялото възможно най-дълго и малко по малко да попадне в кръвообращението, за да увеличи производството на антитела. Основните начини на приложение са подкожни, интрадермални или интрамускулни инжекции; интравенозните и интраперитонеалните инжекции се използват само в специални случаи. За да забави освобождаването на антигена в кръвния поток и да активира имунния отговор, антигенът обикновено се комбинира с емулсия, наречена адювант. Най-известният несъмнено е адювантът на Freund, който е съставен от минерално масло, добавено към емулгиращ агент (непълен адювант) и частици от инактивиран туберкулозен бацил (пълен адювант). Въпреки това, този тип процедури, свързани с колета, са болезнени за животните и са силно обезкуражени от агенциите за хуманно отношение към животните. По-рядко се използват други продукти като соли на стипца, метилиран серумен говежди албумин и др.
Имунната система сравнително лесно произвежда антитела срещу големи молекули като протеини и полизахариди, тези молекули се наричат имуногени. Малките молекули (напр. Стероидни хормони, малки пептиди и др.) Обаче не са много антигенни. Въпреки това, антитела могат да бъдат произведени срещу малки молекули, които след това се наричат "хаптени". На първо място е необходимо тези малки молекули да се конюгират върху вектори ("носители"), протеини като албумин или лимпетен хемоцианин (вид безгръбначни). Този комплекс, веднъж инжектиран в животното, ще индуцира образуването на антитела срещу хаптена като такъв и вектора. След освобождаване на антителата срещу хаптена на тези, които разпознават вектора, тези антихаптени могат да бъдат използвани. По този начин можем да приготвим антитела срещу определени хормони, лекарства или малки пептиди.
Серумът, съдържащ желаното антитяло, се нарича антисерум. Обикновено съдържа няколко вида различни антитела (около десет клонотипа), насочени срещу няколко епитопи (детерминанти или места на свързване) на един и същ антиген, нарича се този поликлонален препарат. С такава смес една и съща антигенна молекула може да свързва едновременно няколко различни антитела, всяко към своя специфичен епитоп. Разработени са техники за изолиране и клониране на лимфоцити, които произвеждат само един молекулярен вид (т.е. клонотип) на антитела, тези антитела се наричат моноклонални. Тези антитела разпознават само един епитоп на антигена.