Влиянието на пренаталния стрес върху миелинизацията и формирането на невронната мрежа
1 Влиянието на пренаталния стрес върху миелинизацията и формирането на невронната мрежа в мозъка на феталната овца Дисертация за получаване на академична степен доктор медицина (д-р мед), представена на Съвета на Медицинския факултет на университета „Фридрих Шилер“ Йена от Джулия Куенд, родена на 05. Септември 1987 г. в Гота
2 рецензенти: 1. проф. Д-р мед. Матиас Шваб/Йена 2. Проф. Д-р мед. Ричард Бергер/Нойвид 3. PD Dr. мед. Ден на обществената отбрана на Бернд Ромейке/Йена:
3 Съдържание Съдържание СПИСЪК НА СЪКРАЩЕНИЯТА I 1 РЕЗЮМЕ 1 2 ВЪВЕДЕНИЕ Клинично значение на пренаталния стрес за плода Развитие на мозъка на плода Ембрионално развитие на мозъка Клетъчна пролиферация и миграция Невронална и глиална диференциация Мозъчна миелинизация Структура и биохимичен състав на миелиновата обвивка Функция и значение на миелина миелинът ми функция Миелинизация Ефекти от пренаталния стрес върху развитието на мозъка на плода. Мозъчни ефекти от майчин стрес. Мозъчни ефекти от пренатална глюкокортикоидна терапия. Регулиране на оста на стреса. Ефекти от майчин стрес и пренатална глюкокортикоидна терапия върху развитието на стресовата ос. Механизми на ефектите от пренаталния стрес. на глюкокортикоиди Пренатален стрес и хормони на растежа Цел на дисертацията 22
4 Съдържание 3 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ Експериментален експериментален протокол Екстракция на мозъка на плода и подготовка на пробите Хистохимично и имунохистохимично оцветяване Общ преглед на оцветяване с хематоксилин-еозин Сребърна импрегнация по Bielschowsky Имунохистохимично откриване на MBP Light микроскопски и PC-базирани резултати от оценка на телесното тегло и РЕЗ-базирани оценки пренатален стрес мозъчни ефекти на пренатален стрес формиране на невронни процеси в бялото вещество подкорково бяло вещество корпус калозум дълбоко бяло вещество корона радиата капсула интерна миелинизация на нервни процеси в бяло вещество подкорко бяло вещество корпус калозум дълбоко бяло вещество - корона радиата капсула вътрешно образуване на нервни структури в Хипокампус (регион CA3) 64
5 Съдържание 5 ДИСКУСИЯ Дискусия на методи, животински модел, модел на стрес, хистология, количествен анализ на изображението, Дискусия на резултатите, пренатален стрес и растеж на плода Ефекти след пренатален стрес върху хипокампуса 8 ПРИЛОЖЕНИЕ Благодарности Декларация за чест 103
6 Списък на съкращенията Списък на съкращенията ABC ACTH ADHD AK AP AP + T AP + T + S Aqua dest. AVP BM CNP (p) crh GR GT HE HHN ос 11ß-HSD2 IGF MAG MBP MOG MR MW OMgp PBS PLP REM RT SEM SSW Avidin-Biotin-Complex Адренокортикотропен хормон Разстройство на вниманието/хиперактивност Работен буфер на антитела Работен буфер + Triton-X-100 работен буфер + Triton + Serum Aqua destillata (дестилирана вода) аргинин-вазопресин бетаметазон 2-3-Цикличен нуклеотид 3-фосфохидролаза (плацентарен) кортикотропин-освобождаващ хормон глюкокортикоидни рецепторни гестационни дни хематоксилин-еозин хипоталамус-хипофиза-хипофиза-хипофиза-хипофиза Хидроксистероидна дехидрогеназа тип 2 Инсулиноподобен растежен фактор Миелин асоцииран гликопротеин Миелин основен протеин Миелин/олигодендроцит гликопротеин Минералокортикоиден рецептор Средна стойност Олигодендроцитен миелин протеин Фосфатен буфер Протеолипиден протеин Стайна температура Стандартна грешка на средната стойност
18 2 Индукция на первентрикуларна левкомалация (увреждане на бялото вещество по време на преждевременно раждане) около времето на гестацията 0,65 (съответстващо на гестационната седмица в човешкия плод), висока степен на сравнимост на мозъчното развитие между феталните овце и хората. Това се подкрепя от факта, че в този времеви прозорец започва съзряването на олигодендроцитите във феталния мозък на овцете и в същото време при недоносени бебета може да се наблюдава висок риск от увреждане на незрелото, перивентрикуларно бяло вещество (Back et al. 2006, 2001) . По време на раждането мозъкът на създадения човек показва малко по-висока степен на зрялост от тази на хората (McIntosh et al. 1979, Astrom 1967). Това може да предполага, че творческият ум съзрява по-бързо през последния триместър. 12
23 2 Въведение координиран физиологичен отговор на различни концентрации на кортизол (глава 2.4.2). Фиг.2.3: Хипоталамус-хипофиза-надбъбречна ос и пътища на отрицателна обратна връзка. Кортикотропин освобождаващ хормон (CRH), аргинин вазопресин (AVP), проопиомеланокортин (POMC), адренокортикотропен хормон (ACTH), паравентрикуларно ядро (NPV). Променено от Metthews
30 2 Въведение показва подобен временен ход на мозъчно развитие на хората, дори ако той узрява малко по-бързо. Общо бяха оценени мозъците на 45 работници, които бяха хронично стресирани между 0,20-0,66 бременност (GT) чрез 180-минутна изолация два дни в седмицата. Тъй като овцете са стадни животни, изолацията е основен стрес за този вид. За да се покажат възможни трайни ефекти, мозъците бяха оценени по време на 0.73 (110-та GT, продължителност на бременността 150 дни) и 0,86 от бременността (130-та GT). Резултатите имат за цел да помогнат за изясняване на ефектите от пренаталния стрес върху мозъчната функция в по-късен живот. 24
32 3 Материали и методи Изолирани в близост до други животни, така че в края на протокола всяко животно е било изложено на индивидуална изолация 20 пъти. Тъй като овцете са стадни животни, те са особено чувствителни към този стрес. Измерванията на нивото на кортизол преди и по време на изолацията успяха да потвърдят този ефект (Rakers et al. 2012). Стресова група Контролна група Синхронизация на цикъла на еструса и планирано чифтосване Сравнение Подходящо отглеждане при овчарите Транспорт на бременни животни до лаборатория за изпитване Стрес чрез изолиране 2 пъти седмично в продължение на 3 часа Хронична апаратура Получаване на мозъка на плода - Група 1 Получаване на мозъка на плода - Група 2 Естествен срок на фиг. .3.1: Експериментален протокол Между 100-та и 110-та GT, плодовете са инструментирани с помощта на катетри, които са били използвани за проверка на вътреутробните стресови реакции (освобождаване на ACTH и кортизол). Тяхната оценка не е предмет на тази работа (вж. Rakers 2012). След приключване на експериментите и оперативното развитие на плодовете се определя теглото на тялото и мозъка. Тези измервания са направени на 26
36 3 Материал и методи за възходяща алкохолна серия, дехидратирана и затворена с монтажна среда Neo-Mount (MERCK GmbH, Дармщат, Германия) Подробният протокол на оцветяването може да бъде намерен в таблица 3.2. Средно обезпаразитяване: 2x Neoclear 2x изопропанол 100% 1x изопропанол 80% 1x изопропанол 50% дестилирана вода. Импрегнация със сребро: AgNO 3 20% 2x аква дест. Амонячен разтвор на сребърен нитрат дестилирана вода + nh 3 (4: 1) Na тиосулфат 5% дестилирана вода от чешмата. Дехидратация: изопропанол 50% изопропанол 80% 2x изопропанол 100% 2x Неоклеарно включване на балсам с ентеланово време [мин]/температура [C] 10/RT 5/RT 5/RT 5/RT 3/RT 90///RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT Таблица 3.2: Протокол за импрегниране със сребро съгласно Bielschowsky. RT стайна температура. Разтворите се приготвят, както следва: 20% разтвор на сребърен нитрат (AgNO 3): 100 ml дестилирана вода g сребърен нитрат 5% натриев тиосулфат (Na2S2O3): 100 ml дестилирана вода. + 5 g натриев тиосулфат за разтвор за проявяване: 25 ml дестилирана вода, mg лимонена киселина (Fluka Chemie, Buchs, Германия) + 5 ml 36% формалин (Carl ROTH GmbH, Карлсруе, Германия) + 8 µl концентрирана азотна киселина HNO 3 (Fluka Chemie, Buchs, Германия). 30-ти
40 3 Материал и методи 2xAP + T ABC комплекс: AP + T + разтворA + разтворB AP + T 2x PBS дестилирана вода. 3'3-диаминобензидин (DAB) 2x аква дест. Дехидратация: изопропанол 50% изопропанол 80% 2x изопропанол 100% 2x Neoclear 100% балсам включване с Entellan 5/RT 60/37 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT 20 μl всеки от разтвори А и В в 1 ml AP + T 1Set (H2O2 + DAB) за 5 ml дестилирана вода, филтрирайте с филтър Millipore Таблица 3.3: Протокол за имунохистиохимично откриване на MBP. Разтворите се приготвят, както следва: Цитратен буфер: 1 литър дестилирана вода. + 2,94 g натриев цитрат (Fluka Chemie, Buchs, Германия), рН 6,0. PBS: 1 литър дестилирана вода. + 1 g D-PBS работен буфер: 500 ml PBS + 2,5 g говежди серумен албумин (албумин от говежди серум, минимум 98%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Германия) µl TWEEN 20 (полиоксиетилен сорбитан монолаурат) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Германия) ph 7.5. DAB разтвор (Sigma Fast DAB субстрат): 2 таблетки (урея водороден пероксид и 3,3-диаминобензидин) в 5 ml дестилирана вода. въртете се, докато готовите таблетки се разтворят напълно. 34
42 3 Материал и методи Фиг.3.3: Оцветяване с общ преглед на H&E е модифицирано, според The Sheep Brain Atlas, State of University Brain Biodiversity Bank, National Science Foundation Ляво: Подкорково бяло вещество във фронталната кора: близо до кората [1] и отдалечено от кората [2]; Corpus callosum [3]; Corona radiata [4]; Вътрешна капсула [5]; SV: странична камера. Вдясно: CA3 регион в хипокампуса: вентрален участък [1], гръбен участък [2] 36
43 3 Материал и методи След цифровото съхранение, записите се оценяват в програма за обработка на изображения (Scion Image 1.62 NIH, САЩ). Първо цветните изображения бяха преобразувани в черно-бели изображения с 256 нива на сивото. Площта на положителната маркировка в представителна секция беше определена чрез анализ на изображението. Областта на имуномаркировката/сребърната импрегнация отразява имунохистохимичното разпределение на антигена/плътността на клетъчните процеси. В сравнение с микроскопичното изображение, горната и долната прагова стойност бяха зададени под визуален контрол. Тези прагови стойности формират диапазон за селективно представяне на положителната MBP имунореактивност или сребърно оцветените нервни влакна. (виж фиг. 3.4, червена маркировка). Фиг. 3.4: Анализ на изображението с помощта на сиви стойности A: Микроскопско изображение: Невронални процеси в подкорковата бяла материя на фронталната кора, отдалечена от кората. 37
44 3 Материал и методи Б: Маркиране на оцветените разширения на клетки в изображението в сивата скала В сравнение с микроскопичното изображение, в изображението на сивата скала е дефинирана сива зона (маркирана в червено на изображението), която съответства на положителния сигнал на сребърната импрегнация. Тази площ се измерва от програмата за анализ на изображения. 38
61 Област на MBP-IR [10-3 mm²] 4 резултата Подкорково бяло вещество - близо до кората 1.00 0.50 $$$ $$$ (n = 9) (n = 11) Контролен стрес (n = 15) (n = 10) 0, гестационна възраст [d] Фиг. 4.18: Ефекти на възрастта и стреса върху миелинизацията на невроналните процеси в подкорковата бяла материя на фронталната кора в близост до кората. MW ± SEM. $$$ p 62 4 Резултати Клетъчните тела и нервните процеси в подкорковото бяло вещество, отдалечено от кората, са ясно маркирани като MBP-положителни (фиг. 4.19). Фиг. 4.19: Микрофотографии на нервните процеси в подкорковото бяло вещество на фронталната кора, отдалечена от кората. Имунохистохимично откриване на MBP. Тяло на невроналния процес A: контролно животно в гестационен ден 110 B: животно в стрес в гестационен ден 110 C: контролно животно в гестационен ден 130 D: животно в стрес в гестационен ден 130
72 Област на сребърна импрегнация [10-3 mm²] 4 резултата 1,50 Хипокампус CA 3 регион, вентрална секция $ 1,00 0,50 (n = 9) (n = 7) (n = 6) * (n = 8 ) Контролен стрес 0, гестационна възраст [d] Фиг. 4.29: Ефекти на възрастта и стреса върху нервната мрежа в хипокампуса CA3 регион, вентрална секция. MW ± SEM; * p 73 4 Резултати Фиг. 4.30: Микрофотографии на невроналната структура в хипокампуса CA3 регион, дорзална част. Импрегниране със сребро. Клетка с ядро Невронален процес A: контролно животно в гестационен ден 110 B: животно в стрес в гестационен ден 110 C: контролно животно в 130 гестационен ден D: животно в стрес в гестационен ден 130