Влиянието на холестерола върху подвижността на външните космени клетки на кохлеята на морското свинче

Влиянието на холестерола върху подвижността на външните космени клетки на кохлеята на морски свинчета и върху моторния протеин prestin Йоханес Майкъл Шмид

От клиниката и поликлиниката по медицина на ушите, носа и гърлото в Университета „Лудвиг Максимилианс“ в Мюнхен Директор: проф. Д-р. мед. Александър Бергхаус Влиянието на холестерола върху подвижността на външните космени клетки на кохлеята от морски свинчета и върху двигателния протеин Престин Дисертация за придобиване на докторска степен по медицина в Медицинския факултет на Университета Лудвиг Максимилианс в Мюнхен, представена от Йоханес Михаел Шмид от Мюнхен през 2011 г.

С одобрението на Медицинския факултет на Университета в Мюнхен Докладчик: Съдокладчик: Priv.-Doz. Д-р мед. М. Канис проф. Д-р Магдалена GÉtz проф. Д-р Франк Стауб Дийн: проф. Д-р мед. Д-р h.c. M. Reiser, FACR, FRCR Ден на устния изпит: 09.06.2011

I Съдържание Съдържание Страница I. Въведение. 1 1. Значение на изслушването. 1 2. Анатомия на вътрешното ухо. 2 3. Физиология на кохлеята. 5 3.1 Предаване на звук и тонотопия. 5 3.2 Ендокохлеарен потенциал и механична електрическа трансдукция. 5 3.3 Усилване на сигнала от външните космени клетки. 7 3.4 Предаване на информация през вътрешните космени клетки. 11 4. Двигателен протеин и фина структура на клетъчната мембрана на външните космени клетки. 11 4.1 Идентификация на Prestin. 11 4.2 Фина структура на клетъчната мембрана на външните космени клетки. 12 4.3 Структурна структура и локализация на престин. 13 4.4 Функция на Престин. 15 5. Нелинеен капацитет и електромобилност на външните космени клетки. 6. Холестеролът и неговото влияние върху слуховия процес. 17 6.1 Химична структура и общо значение. 17 6.2 Значение на холестерола за плазмената мембрана. 19 6.3 Ефекти на холестерола върху вътрешното ухо. 20 7. Въпроси и цели. 24 II. Материал и методи. 26 1. Материал. 26 1.1 Устройства. 26 1.2 Консумативи. 27 1.3 Химикали и разтвори. 27 1.3.1 Химикали. 27 1.3.2 Решения. 28 1.4 Софтуер. 29

III Съдържание 2. Подвижност на външните космени клетки при физиологични условия. 53 3. Влияние на холестерола върху подвижността на външните космени клетки. 55 3.1 Общи съображения. 55 3.2 Зависимост на подвижността на външните космени клетки от концентрацията на холестерола. 56 3.2.1 Влияние на холестерола върху максималното скъсяване и максималното удължаване. 56 3.2.2 Влияние на холестерола върху максималния наклон, върху средните промени в дължината и върху напрежението V pkc. 58 3.3 Влияние на холестерола върху двигателния протеин и върху клетъчната мембрана на външните космени клетки. 60 3.3.1 Влияние на хлорида върху подвижността на външните космени клетки. 60 3.3.2 Влияние на холестерола с половин максимална престинна функция. 62 V. Резюме и перспективи. 64 VI. Списък на съкращенията. 68 VII. Списък на фигурите. 69 VIII. Списък на таблиците. 71 IX. Библиография. 72 X. Благодарности. 78 XI. Публикации. 79 XII. Продължи. 81

I. Въведение 4 Фигура 1: Анатомия на вътрешното ухо A: Преглед с отрязана отворена улитка B: Напречно сечение през намотките на ушната мида C: Схематично представяне на органа на Corti с външната и вътрешната космена клетка (модифицирана от Hudspeth 2000 и Knirsch 2007) (Knirsch 2007 )

7 I. Въведението варира между -60 mv и -80 mv (Rajagopalan et al. 2007) (Фигура 3). Движещата сила зад тези йонни течения е потенциалната разлика между мембранния потенциал на космените клетки и ендокохлеарния потенциал (Klinke et al. 2005; Schmidt 2007; Speckmann et al. 2008). Фигура 3: Рецепторен потенциал като функция на отклонението на стереовилите (модифициран от Speckmann et al. 2008 и Rajagopalan et al. 2007) 3.3 Усилване на сигнала от външните космени клетки Притокът на йони в ETC и свързаните с това промени в потенциала активират усилващата функция на ÄHZ (Breneman et al. 2009). Тази подсилваща функция се основава на два механизма, соматична и цилиарна подвижност. И двата механизма увеличават трептенията на пътуващата вълна до 1000 пъти с активни движения на EHZ (Schmidt 2007; Dallos 2008). При цилиарната подвижност това се случва чрез активни движения на стереовили, докато соматичната подвижност се основава на удължаване и скъсяване на клетъчното тяло. Този механизъм, известен като кохлеарния усилвател, увеличава честотната селективност и чувствителността на слуховия орган. Дали са ÄHZ от ототоксични вещества

I. Въведение 10 Фигура 5: Цилиарна подвижност (модифицирана от Fettiplace 2006 и Breneman et al. 2009) Вземайки заедно текущите резултати от изследванията, Хъдспет предлага, че цилиарната подвижност представлява вид предусилвател и честотен модулатор, докато соматичната подвижност действа като краен усилвател би могъл (Hudspeth 2008). Кохлеарният усилвател работи динамично. Той предлага възможност за усилване на много ниска интензивност на звука, докато големите интензитети на звука се обработват без усилване. Това предотвратява увреждане на вътрешното ухо. Автоматичният контрол на усилването под формата на инхибиторни ефекти осигурява механичен баланс. Най-добре изследваният инхибиторен ефект се медиира от невротрансмитера ацетилхолин. Ацетилхолинът е основният предавател на еферентните влакна, които инервират EHZ. Чрез свързване със специфични рецептори, Ca 2+ се влива в клетката. Това води до забавено изтичане на K + и по този начин до хиперполяризация на клетката. Това води до намаляване на чувствителността към напрежение на ETC и до инхибиране на електромобилността (Frolenkov 2006; Ashmore 2008).

12 I. Въведение. Либерман и сътр. са успели да потвърдят тази теория през 2002г. Те показаха, че когато екзони 3-7 от кодиращия ген бяха изтрити, мишките показаха загуба на продуктите на изкривяване на отоакустичните емисии (DPOAE) и електромотивността на ETC, както и увеличаване на прага на слуха от 40-50 db (Liberman et al. 2002). 4.2 Фина структура на клетъчната мембрана на външните космени клетки Моторният протеин се намира почти изключително в страничната клетъчна мембрана на ÄHZ (Ashmore 2008) (Фигура 6). Фигура 6: Структура на страничната клетъчна мембрана на външната космена клетка (модифицирана от Oghalai et al. 1998) В апикалния край на ETC, стереовилите са прикрепени към кутикуларната плоча. Ядрото е в основата на клетката. Клетъчната мембрана на страничната стена има уникална трислойна структура. Външният слой е плазмената мембрана (PM), в която са вградени 3000 до 6000 престин молекули на µm². Престинната плътност зависи от местоположението на ETC в ушната мида. Апикална EHZ, че

I. Въведение 14 Триизмерната реконструкция на Prestin от Mio et al. доведе до протеин с размери 7,7 nm x 7,7 nm x 11,5 nm под формата на пистолет с форма на куршум с вътрешни кухини (Mio et al. 2008) (Фигура 8). Фигура 7: Схематично представяне на структурата и локализацията на престин в плазмената мембрана на външните космени клетки (модифицирана от Ashmore 2008) Фигура 8: Триизмерно представяне на престин в плазмената мембрана (модифицирана от Mio et al. 2008)

17 I. Въведение Сравнение с изследванията на промените в дължината на ÄHZ с други методи, напр. видео микроскопията, използвана в тази работа (Ashmore 2008). Фигура 10: Графично представяне на NLC, движението на заряда и промяната в дължината като функция на мембранния потенциал (модифициран от Ashmore 2008) Много фактори, като напр. състоянието на фосфорилиране на вътреклетъчните протеини или вещества като хлороформ, гадолиний, салицилати или холестерол може да повлияе на тези процеси. Премествате тези криви или в деполяризиращата, или в хиперполяризиращата посока, или променяте размера на най-голямата промяна в дължината или най-голямото движение на заряда. В тази работа е изследван ефектът на холестерола върху подвижността на EHZ (Ashmore 2008). 6. Холестеролът и неговото влияние върху слуховия процес 6.1 Химическа структура и общо значение Нобеловият лауреат Майкъл Браун описва холестерола като молекула с глава на Янус (Berg et al. 2007). От една страна той е незаменима част от нашите клетки, от друга страна уврежда човешкия организъм напр. поради атеросклероза (Yeagle 1985). Холестеролът представлява съществена част от плазмената мембрана на повечето

25 I. Въведение За да може да се прави разлика между холестерола върху клетъчната мембрана и върху моторния протеин престин, престиновата функция на ETC трябва да бъде намалена чрез намаляване на вътреклетъчната концентрация на хлорид до приблизително 50% (Oliver et al. 2001). След това ETC с половината от престин функцията се разделят на две тестови групи. Първата група се изследва с извънклетъчна концентрация на холестерол 1,0 mmol/l, втората група без добавен холестерол. След това оценката на тези експерименти трябва да отговори на въпроса дали влиянието на холестерола е по-скоро резултат от ефекти върху пасивните свойства на клетъчната мембрана или се основава повече на ефект върху функцията на моторния протеин престин.

II. Материал и методи 26 II. Материал и методи 1. Материал 1.1 Подготовка на оборудването Стереомикроскоп източник на студена светлина Подготовка на разтворите Wild M3C KL 1500 електронен осмометър на точката на замръзване Osmomat 030 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Германия Schott AG, Mainz, Германия Gonotec GmbH, Берлин, Германия Пипети Референтен Хамбург, Eppendorf AG, Стимулатор за стягане на стъклен електрод Пач-скоба-маса/Фарадеева клетка Пач-скоба-усилвател Пач-пипета/предусилвател DMZ-Универсален издърпващ микро-g Axopatch 200A CV-201A headstage Германия Zeitz Instruments GmbH, Martinsried, Германия TMC, Peabody, MA, САЩ Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA

27 Аналогово-цифров преобразувател Digidata 1200 Микроманипулатор Модел XR-6 Видеозаписи Микроскоп Axiovert 135 Видеокамера Moticam 2000 II. Материал и методи Axon Instruments Inc., Фостър Сити, Калифорния, САЩ Narishige Scientific Instrument Lab., Токио, Япония Carl Zeiss AG, Göttingen, Германия Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Германия 1.2 Консумативи за накрайници за пипети 10 µl, 100 µl, 1000 µl боросиликатни стъклени капиляри GC150TF-10 Петри, покрити с поли-L-лизин покритие (Ø 35 mm) Eppendorf AG, Хамбург, Германия Clark Electromedical Instruments, Pangbourne, Рединг, Великобритания Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Германия 1.3 Химикали и разтвори 1.3.1 Химикали натриев пентансулфонат водоразтворим холестерол HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA Sigma-Aldrich Co., St Луис, Мисури, САЩ Biochrom AG, Берлин, Германия

II. Материал и методи 28 1.3.2 Разтвори Пипетни разтвори (вътреклетъчни разтвори) (в mmol/l) Вещество Стандартен разтвор Разтвор с 6 mmol/l хлорид KCl 140 6 Натриев пентансулфонат 0 134 MgCl 2 6H 2 0 2 2 EGTA 11 11 CaCl 2 0, 1 0,1 Hepes 10 10 KOH за определяне на рН стойност от 7,2 глюкоза за определяне на осмоларността на 315-320 разтвори за мосмол/л баня (извънклетъчни разтвори) (в mmol/l) вещество стандартни разтвори на разтвор с (разтвор HBSS) 0,1 mmol/l, 0,5 mmol/l, 1,0 mmol/l, 1,5 mmol/l холестерол 0 холестерол CaCl 2 1,25 1,25 глюкоза 5,55 5,55 KCl 5,4 5, 4 KH 2 PO 4 0,35 0,35 MgSO 4 7H 2 O 0,81 0,81 NaCl 137 137 Na 2 HPO 4 2H 2 O 0,34 0,34 Hepes 5 5 NaOH за задаване на ph стойност на 7,2-7,4 глюкоза за регулиране на осмоларността от 300-310 мосмола/л

II. Материал и методи 32 Фигура 13: Конфигурации за измерване на техниката за закрепване на скоби и тяхното производство (модифицирано от Numberger 1996) 1. Прикрепена към клетка конфигурация: Прикрепената към клетка конфигурация съответства на началната позиция за всички други конфигурации. В тази конфигурация не е възможно да се намеси във вътрешноклетъчната среда на клетката. Клетката се измерва в състояние, при което всички протеини, включително йонните канали, са в естествената си среда от вътреклетъчната страна на мембраната. Само зоната под пипетата, пластирът, се контролира от извънклетъчния потенциал на усилвателя.

II. Материал и методи Оборудвана е 34 подвижна микроскопска маса. Уголеменото изображение е записано с цифрова видеокамера (Moticam 2000, Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Германия) и е записано цифрово на компютър. За позициониране на пластирната пипета е използван хидравличен микроманипулатор (Model XR-6, Narishige Scientific Instrument Lab., Токио, Япония). Електродът за баня във вътрешността на пипетата за свързване е свързан с предусилвател (CV-201A headstage, Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA). Фигура 14: A: Структура на станцията за измерване на скобата B: Уголемяване на микроскопската маса с чаша на Петри и пластирната пипета (модифицирана от Scheel 2002) (Scheel 2002) Отрицателното налягане, необходимо за аспирация на клетките, е създадено от спринцовка за перфузор, свързана към държача на пипетата. Предварителният усилвател е свързан към усилвател (Axopatch 200A, Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA),

37 II. Материал и методи 2.2.6 Измерване на съпротивлението на електрода и корекция на отместването Пипетата се напълва и затяга в държача на пипетата, така че върхът на пипетата се потапя в разтвора на банята. Лекото свръхналягане предотврати запушването на пипетата чрез засмукване на частици. Програмата pclamp 8 генерира отрицателен тестов импулс с напрежение 5 mV за период от 5 ms. От получената токова реакция програмата изчислява съпротивлението на електрода въз основа на закона на Ом. Това съпротивление е било между 3 MΩ и 6 MΩ при тестовете (Фигура 15 А). Фигура 15: Промяна в съпротивлението и текущата реакция на тестовия импулс, индуциран от пластирната пипета, като функция от конфигурацията на апарата за скоби (модифициран от Numberger 1996)

II. Материал и методи 38 Напреженията, които не идват от клетката или от тестовия импулс, се наричат компенсиращи потенциали (Numberger 1996). Тези потенциали, задействани от поляризация на електродите от сребро/сребърен хлорид и от потенциали за преход между различни концентрации на електролита във ваната и пипетата, могат да фалшифицират резултатите от измерването. Тези потенциали трябва да се компенсират с помощта на усилвателя на пластирната скоба преди всяко измерване и не трябва да надвишават 10 mV (Numberger 1996). 2.2.7 Цяло-клетъчна скоба и стимулация Подходящи жизненоважни клетки бяха избрани под микроскоп при ниско увеличение. Критериите за жизненост на Zajic и Schacht (Zajic et al. 1987) бяха използвани за оценка на клетките. Клетките показаха сковани на вид стереовили, клетъчно ядро, разположено на базалния полюс, леки, произволни движения на цитоплазматичните частици и постоянно непокътната клетъчна мембрана (Фигура 16). Фигура 16: Изолирана външна космена клетка с остатъци от поддържаща тъкан и кръпка с пипета