Визуализация на Candida albicans в миши стомашно-чревен тракт с помощта на флуоресцентен In Situ
Обобщение
Целта на този протокол е да визуализира формата и локализацията на Candida albicans клетки в стомашно-чревния тракт на бозайници.
Резюме
Candida albicans е гъбичен компонент на чревната микробиота при хора и много други бозайници. Въпреки че C. albicans не причинява симптоми при повечето колонизирани гостоприемници, резервоарът за коменсал служи като хранилище за инфекциозни заболявания и наличието на гъбични гърди в червата е свързано с възпалителни заболявания на червата. Тук описваме метод за визуализиране на морфологията и локализацията на клетките на C. albicans в миши модел на стабилна стомашно-чревна колонизация. Колонизацията се установява с помощта на единична доза C. albicans при животни, лекувани с перорални антибиотици. Сегментите на чревната тъкан са прикрепени по начин, който запазва архитектурата на луминалното съдържание (микроорганизми и слуз), както и лигавицата на гостоприемника. И накрая, се извършва флуоресцентна in situ хибридизация, като се използват сонди срещу гъбична рРНК за оцветяване на C. albicans и хифи. Ключово предимство на този протокол е, че той позволява едновременно наблюдение на клетъчната морфология на C. albicans и нейната пространствена връзка със структурите на гостоприемника по време на стомашно-чревна колонизация.
Въведение
Candida albicans е гъбичен коменсал, както и опортюнистичен човешки патоген. Тази мая няма определена екологична ниша и вместо това се разпространява в стомашно-чревния тракт, кожата и пикочо-половите пътища на хора и други бозайници 1. Докато ранните изследвания върху C. albicans се фокусират основно върху потенциала му за вирулентност, няколко скорошни доклада показват, че разпространението на организмите в червата може да играе важна роля в нормалното здраве, включително имунното развитие на гостоприемника. 2, 3, 4. За да улесним изследванията на коменсализма на C. albicans в червата на бозайниците, ние разработихме модел на мишка за стабилна колонизация на GI и метод на флуоресценция in situ хибридизация (FISH) за визуализиране на гъбични клетки от дрожди и хифи в чревния лумен.
В тази статия предоставяме подробни инструкции за установяване на висококачествена колонизация на C. albicans на стомашно-чревния тракт на мишки, за дисекция на храносмилателния тракт на евтаназирани животни, за прикрепване на тъкани по начин, който запазва луминала за откриване на C. albicans в тъканите на гостоприемника, използвайки FISH. В допълнение към див тип и мутантни щамове C. albicans, техниката на сонда може да се използва за доставяне на други микроорганизми. Техниката на фиксиране би била полезна за всяко изследване, при което се желае запазване на съдържанието на червата. Процедурата FISH може да приключи за един ден и може да се използва за локализиране на множество гъбични видове, като се използват множество сонди, обозначени по различен начин.
Протокол
Описаните по-долу стъпки са одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните на UCSF (IACUC).
1. Стомашно-чревна колонизация на мишки с C. albicans с помощта на орален сондаж
2. Подготовка на стомашно-чревна тъкан за хистология
ЗАБЕЛЕЖКА: Този раздел на протокола е адаптиран от Johansson и Hansson 16 .
3. Валидиране на новопроектирани сонди
ЗАБЕЛЕЖКА: Следващият протокол за валидиране на сондите C. albicans е адаптиран от Swidsinski et al. 17 .
4. ОЦЕНЯВАНЕ НА РИБА в тъканите на ГИ тракта
Представителни резултати
Следвайки предоставените инструкции, резултатът от тази техника ще бъде флуоресцентно маркиране на ядра в гостоприемника епител, слуз и C. albicans в отсечени gi тъкани. Клетките от Candida albicans от див тип трябва да изглеждат като кръгли, едноклетъчни клетки на дрожди или силно удължени, понякога разклонени, многоклетъчни хифи (клетъчните деления няма да бъдат видими при хифите). Мутантите на C. albicans могат допълнително да изглеждат като по-малки и леко удължени "сиви" дрожди или като по-големи и леко удължени "GUT" (индуциран от стомашно-чревния тракт) или "непрозрачни" дрожди.
Фигура 1 изобразява иглата за хранене, използвана за орална сонда, както и ключови позиции на иглата по време на процедурата за сонда. Фигура 2 осигурява типична настройка, използвана за дисекция на органи и поява на миши стомашно-чревни сегменти.
Фигура 3E-G изобразяват C. albicans в дебели черва на мишки, оцветени със специфичната сонда C. albicans (Фигура 3Е) или панфуноналната сонда (Фигура 3F, G). C. albicans изглежда червено на тези изображения, ядрата на гостоприемниковите клетки са сини, а слузният слой е зелен. В дебелото черво се срещат както кръгли дрожди, така и много удължени хифи (бели върхове на стрели). Моля, обърнете внимание, че оцветяването е по-ярко със сондата от гъбички. Фигура 3G представлява ume6 мутант в същото отделение, оцветен с панфуноновата сонда. Ume6 кодира транскрипционен фактор, който е необходим за образуването на хифа при in vitro условия 19. Интересното е, че заключеният дрожден фенотип, показан от този мутант при in vitro условия, не се рекапитулира в червата, което предполага, че в гостоприемник 12 трябва да се активира излишен фактор. Фигура 4 представлява появата на диви видове C. albicans в различни сегменти на миши стомашно-чревен тракт, включително региони в непосредствена близост до лигавицата на гостоприемника и по-централни области на чревния лумен.