Високопроизводителна ДНК екстракция и генотипизиране на 3dpf Zebrafish Larve чрез Fin Clipping Protocol

Обобщение

Зебраните са били използвани като надеждни генетични модели на организми в биомедицински изследвания, особено с появата на техники за генетична модификация. При съмнение за фенотипове на ларвите идентифицирането на екстракционната ДНК и генотипа може да бъде трудно. Тук ние описваме ефективна процедура за генотипиране на ларвите на зебра, чрез изрязване на опашката, още 72 часа след оплождането.

Резюме

Въведение

Данио рерио (Danio rerio) е гръбначен организъм, широко използван като модел за изследване на заболяването, както и за предклинично тестване на терапевтични хипотези 1, 2, 3 Тези животни имат кратко поколение време, лесни за работа, показват висока скорост на възпроизводство, ниска цена и лесно се поддават на генетична манипулация чрез микроинжектиране на ДНК в 4 ембриони. Чрез нарастващото развитие на нови трансгенни технологии и технологии за редактиране на гени като Zinc Finger Nucleases (ZFN) 5, TAL-подобни ефекторни нуклеази (TAPS) 6, 7 и редовно разпръснатите кратки Palindromic повторения (CRISPR)/CRISPR клъстер 9 (Case9) система 8, рибата зебра е готова драстично да подобри разбирането на няколко патологични състояния. Тези технологии са използвани за създаване на целенасочени отвори както в соматични, така и в зародишни клетки в зебра, ефективно обхващащи генетично модифицирани животни 8. Последни примери в литературата, включително разработването на генетични модели на епилепсия и метаболитни нарушения при зебра 3, 9, 10, 11, 12 .

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Процедурите с животни са одобрени и отговарят на насоките за грижа за животните, изложени от Канадския съвет по грижа за животните и Комитетите по грижа за животните към Университета в Отава.

  1. Подготовка на дисекционната повърхност чрез залепване на 9-сантиметров капак на Петри с автоклавна лента върху вътрешната му повърхност. Поставете го под стереомикроскоп.
  2. Място на оплождане след 3-5 дни (dpf) ларви на зебра в чаша на Петри и анестезирайте в ˜1,5 mM трикаин в ембрионална среда x E3 1 (5 mM NaCl, KCl, 0,33 mM CaCl2, 0, 33 mM MgSO4, 0,17 mM, рН 7,2).
  3. Нарежете края на върха на пипетата P1000 с чифт ножица или нож за бръснене до диаметър 2 mm, за да поберете ларва dpf 3 с минимално напрежение.

2. окончателно изрязване на ларви на данио

3. Екстракция на геномна ДНК

  1. Запечатайте 96-ямковата PCR плака и центрофугирайте пробите при 1000 х g за 1 минута, за да се гарантира, че всички филтърни хартии са потопени в разтвор на NaOH.
  2. За лизис на тъкани, топлинни проби в термоциклер при 95 ° C за 5 минути, последвано от охлаждане при 4 ° C за 10 минути.
  3. Добавете 6 μL от 500 mM Tris-HCl, рН 8,0 към всяка проба. Вихър.
  4. Накратко центрофугирайте плаката при 1500 xg, в продължение на 5 минути при стайна температура.
  5. Използвайте 1,5 μL ДНК супернатант за PCR реакция.
  6. Пригответе PCR за генотипиране на ларвите, както е посочено в таблица 1-2.
    Забележка: Този протокол е тестван в две приложения: мултиплексни PCR реакции, разкриващи генотип с използване на гелове от агароза 9 и хетеродуплексен анализ (HMA), разкриващи генотипове, използващи полиакриламиден гел (PAGE). Електрофореза 17 .

4. алтернативна геномна екстракция с използване на хелатна смола

  1. Завършете стъпка 2.5 чрез добавяне на филтърна хартия с нарязана перка към 96-ямкова PCR плака, съдържаща 30 μL 5% хелатна смола (стирол-дивинилбензолов съполимер, съдържащ сдвоени иминодиацетатни йони).
    Забележка: Този вид смола се използва често за лизис на тъкани и за получаване на PCR-готова ДНК по бърз и ефективен начин 18 .
  2. Следвайте стъпки 2.6-2.8, както е показано.
  3. Колбирайте 96-гнездовия PCR и за кратко центрофугирайте пробите, за да се уверите, че цялата филтърна хартия е вградена в хелатообразната смола.
  4. За лизис на тъкани, топлинни проби в термоциклер при 95 ° C за 15 минути, последвано от охлаждане до 4 ° C за 10 минути.
    Забележка: Тази стъпка позволява лизис и последващо свързване на перлите на полярната смола с клетъчни компоненти, докато ДНК и РНК остават в разтвор.
  5. Накратко, центрофугирайте пробите за гранулите пелетна смола и получете ДНК в суспензията.
  6. Следвайте стъпки 3.5 до 3.6, за да завършите процедурата за генотипиране.

5. приложение 1: Мултиплекс PCR, последван от анализ на агарозен гел

6. приложение 2: Хетеродуплекс чугунен анализ

  1. Пригответе PAGE 12% гелове, като използвате разделителната пластина 1,5 мм и гребените с 15 проби. Пригответе два PAGE гела, като използвате 12,21 ml ddH2O, 2,52 ml 10 x Tris/Borate/EDTA (TBE), 10 ml 30% акриламид, 250 μL 10% амониев персулфат (APS) и 20 μL тетраметилетилендиамин (TEMED). Използвайте 1 х TBE буфер (0,089 М Tris-HCl, 0,089 М борна киселина и 0,002 М тетраоцетна киселина (EDTA)) в буфера.
  2. Загрейте PCR продуктите при 94 ° C за 5 минути.
  3. Охладете тръбите върху лед или в термоциклера за 10 минути при 4 ° C.
  4. Заредете 10 μL/PCR проба и 8 μL маркер за молекулно тегло.
  5. Пуснете PAGE при 150 V 1 x TBE, като използвате система за вертикална електрофореза за 1 час или докато маркерът за молекулно тегло почти достигне долната линия на стъклената плоча.
  6. UV гелът позволява дискриминация на различни генотипове на изображението.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

30 µL. Екстракцията на ДНК с помощта на хелатна смола води до подобен добив, например 0,5 средно 3,8 ng/µL ДНК. Това количество ДНК, събрано от ларви на перки, генерира годна за PCR геномна ДНК с достатъчно качество, за да позволи идентифициране на генотипове. Всяка ДНК проба може да се използва в PCR ˜30 амплификационни реакции. Продуктите за усилване, получени с помощта на праймери Gen1_FW и Gen2_RV, могат да се използват и за приложения за секвениране 9, които идентифицират 5-bp вмъкване в хомозиготни мутанти (aldh7a1 -/-) (Фигура 3 ). Последователността на Sanger е извършена от външна услуга, за да се провери дали PCR продуктите са неподходящи за това приложение. Използвани са ДНК проби от агарозен гел, потвърдени хомозиготни мутанти и WT (n = 3). Получени са високи резултати от 19 Phred (> 30), показващи висококачествени четения, с изключение на първата и последната 40 базови двойки.