Усъвършенстван миши модел за неалкохолен стеатохепатит във връзка с диабет тип 2
Обобщение
Описан е прост и надежден модел на фехтовка, предизвикан от диета за безалкохолен стеатохепатит (NASH), който се постига чрез не-SPF настаняване на животните и прилагането на специфична диета с високо съдържание на мазнини. Ние описваме идентифицирането на подгрупите на черния дроб и мастните клетки, за да рекапитулираме имунните състояния на човека чрез излагане на мишки на микроби от околната среда.
Резюме
Затлъстяването е свързано с хронично, нискостепенно възпаление и инсулинова резистентност, което допринася за нарастващото разпространение на хронични метаболитни заболявания като диабет тип 2 и безалкохолен стеатохепатит (NASH). Последните изследвания показват, че противовъзпалителните имунни клетки инфилтрират затлъстели хипертрофични мастни тъкани и черен дроб. Като се има предвид нововъзникващата роля на имунните клетки в метаболитната хомеостаза, има спешна нужда от количествено определяне и характеризиране на тяхната промяна в развитието на диабет тип 2 и NASH. Въпреки това, животинските модели, които предизвикват патофизиологични характеристики, типични за човешки NASH, са оскъдни.
В тази статия ние предоставяме подробен протокол за идентифициране на подмножества от имунни клетки, изолирани от черния дроб и мастната тъкан в надежден миши модел на NASH, получен чрез поставяне на диетични мишки с високо съдържание на мазнини (HFD) под неспецифични без патогени (SPF) условия без заключване за най-малко седем седмици. Показваме боравенето с мишки при несолени условия, храносмилането на тъканите и идентифицирането на макрофаги, естествени клетки убийци (NK), дендритни клетки, подгрупи В и Т клетки чрез поточна цитометрия. Представени са представителни графици на поточна цитометрия от SPF-HFD мишки и не SPF мишки. За да се получат надеждни и интерпретируеми данни, използването на антитела, прецизни и точни методи за храносмилане и правилните видове в експериментите с поточна цитометрия са ключови елементи.
Интервенцията за възстановяване на физиологичната експозиция на антиген при мишки чрез поставянето им в неславянски условия и неспецифично излагане на микробни антигени може да бъде подходящо средство за изследване на връзката между имунологичните промени, причинени от диетата. Затлъстяването и свързаните с него дългосрочни усложнения.
Въведение
Затлъстяването е многофакторно заболяване и основен рисков фактор за развитие на сърдечни заболявания, инсулт, безалкохолен стеатохепатит (NASH), диабет тип 2 (T2D) и някои видове рак. Разпространението на затлъстяването бързо се увеличава по целия свят. Днес 2,1 милиарда души - почти 30% от населението на света - са с наднормено тегло или с наднормено тегло 1. Асоциираната със затлъстяване инсулинова резистентност може да доведе до T2D, когато изтощените бета-клетки на панкреаса не успеят да компенсират повишената нужда от инсулин за поддържане на глюкозната хомеостаза 2.
Мастната тъкан се състои от различни видове клетки, включително адипоцити, ендотелни клетки, фибробласти и имунни клетки. По време на прогресията на затлъстяването промените в броя и активността на имунните клетки могат да доведат до по-слабо възпаление на хипертрофичната мастна тъкан 3, 4. По-конкретно беше установено, че прекомерният енергиен прием, придружен от хронично повишени нива на кръвната захар, триглицериди и свободни мастни киселини, водят до адипоцитна хипоксия, ендоплазмен стрес в мрежата, нарушена митохондриална функция и повишена секреция на цитокини, което води до активиране на противовъзпалителните мастни клетки 5,6. Досега изследванията са фокусирани основно върху вродения имунитет, но напоследък адаптивните имунни клетки (Т и В клетки) се появяват като важни регулатори на хомеостазата на глюкозата. Те имат възпалителни функции (включително CD8 + Т клетки, Th1 и В клетки) или преди всичко регулаторни функции (включително регулаторни Т (Treg) клетки, Th2 клетки) и могат както да влошат, така и да защитят инсулиновата резистентност от 7,8 ., 9 септември
За да се изследват различните подгрупи на имунни клетки в мастната тъкан и черния дроб при развитието на инсулинова резистентност и NASH в усъвършенстван модел на мишка, който възпроизвежда човешки имунни състояния, мишките бяха поставени в единични клетки в полустерилни условия без бариера. Мишки, които бяха настанени в условия, изложени на антиген, развиха NASH-подобна чернодробна патология само след 15 седмици диета с високо съдържание на мазнини (HFD). В сравнение с подходящите за възрастта SPF мишки, те развиват макровезикуларна стеатоза, чернодробна инфилтрация и активиране на имунни клетки.
Този ръкопис описва силен цитометричен анализ на потока, за да се дефинират и преброят подгрупите на имунните клетки от мастната тъкан и черния дроб на мишката в модел на NASH. Анализът на поточната цитометрия дава възможност за определяне на няколко параметъра на отделни клетки едновременно, за разлика от RT-PCR или имунохистохимични подходи.
В обобщение, нашето проучване предоставя миши модел на краткосрочна HFD за изследване на развитието на инсулинова резистентност и NASH и основните механизми, които също показват вярност към човешкото състояние.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
Това проучване е проведено в съответствие с Ръководството на Националните здравни институти за грижи и употреба на лабораторни животни и Закона за хуманно отношение към животните под надзора на нашия Институционален комитет за хуманно отношение към животните. Протоколите за животни са извършени в съответствие с институционалните етични насоки на Charité Berlin и одобрени от Държавната служба за здравеопазване и социални въпроси и съответстват на насоките ARRIVE.
1. Диета-индуциран животински модел на стеатохепатит
2. Приготвяне на реактиви и разтвори
3-то поколение едноклетъчни суспензии
5. Компенсация, придобиване и регулиране на поточната цитометрия
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
Представителни резултати от извънклетъчното оцветяване на Т клетки в миши черен дроб на изложени на HFD мишки са показани на Фигура 3 А открити в сравнение с HFD SPF мишки. Всъщност по-висок процент от ефекторните запаси CD4 + и CD8 + Т клетки може да бъде открит при изложени на HFD мишки, докато интрахепаталните наивни CD4 + и CD8 + Т клетки са значително по-ниски при експозиция в сравнение с SPF мишки. Седмица 7 (Фигура 3 А).
За да се потвърдят тези резултати, чернодробният възпалителен отговор, свързан с експозицията на антиген, беше изследван чрез оцветяване на чернодробни участъци от мишки, хранени в продължение на 15 седмици 13. Тежка стеатоза, включително увеличаване на големи липидни капчици, водеща до макровезична стеатоза, възпаление на лобелия, хепатоцелуларен балон и нарушена лобулация, е установена при мишки, изложени на HFD, докато само няколко мишки SPF показват леко натрупване на мазнини в черния дроб (Фигура 3Б). Както е на фигурата3C докладва, делът на NK клетките в перигонадната мастна тъкан на изложени на HFD мишки е по-висок, докато HFD-SPF мишките показват по-висок дял на дендритни клетки. Не са открити значителни разлики за макрофагите и моноцитите. Като цяло тези резултати потвърждават по-тежка чернодробна стеатоза при изложени на HFD мишки и по-малки разлики в мастната тъкан между изложени на HFD и SPF мишки.
маса 1 показва антителата, използвани в таблица 1. Антителата, използвани в анализа на поточната цитометрия за екстраекуларно оцветяване на В клетки, макрофаги, NK клетки, дендритни клетки и гранулоцити са в Таблица 2показани.
Изображение 1 : Схематично представяне на стратегия за стробиране, използвана при анализ на поточна цитометрия на затлъстяването (Таблица 1). Първо клетките са затворени на синглети. Тогава отпадъците се елиминират, като се използва площта за разпръскване напред (FSC-A) и площта за странично разсейване (SSC-A) и се избере правилният размер. Клетките също се характеризират с експресията на CD45. Жизнеспособните клетки се избират с маркер на живи/мъртви клетки, багрило за аминна реакция, което не е предназначено за живи клетки, но е предназначено за клетки с компрометирани мембрани. Т клетките бяха разделени на цитотоксични Т клетки (CD8 +) и Т помощни клетки (CD4 +) и разделени на наивни (CD44 + CD62L-), централно съхранение (CD44 + CD62L +), ефекторно съхранение (CD44 + CD62L -) и ефекторни (CD44 - CD62L +) Т клетки. В крайна сметка CD44 + клетките са затворени на KLRG1, CD127 и PD-1. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.
снимка 2 : Схематично представяне на стратегия за стробиране, използвана при анализ на поточна цитометрия на мастните клетки (Панел 2). Дендритните клетъчни стъпала се основават на CD11b и CD11c експресия. Определени бяха следните други популации: В клетки, NK клетки, макрофаги, моноцити и гранулоцити. Данните бяха анализирани със съответния софтуер след придобиване. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.
снимка 3 : Представителен поточен цитометричен анализ на Т клетки, изолирани от миша перигонадна мастна тъкан и черен дроб. (A) CD4 + и CD8 + Т клетки от миши черен дроб от 7 седмици HFD мишки, държани под SPF и изложени условия бяха анализирани чрез поточна цитометрия. Б.) представително оцветяване на 15 седмици HFD SPF и изложени мишки. Инфилтрацията на имунни клетки и диетични фибри хепатоцити (върховете на стрелките) илюстрира NASH. ° С.) Пропорция на вродените имунни клетки със затлъстяване като процент на левкоцитите в HFD мишки, държани под SPF или изложени на условия в продължение на 7 седмици. n = 6-10 мишки на група. Значимостта се определя с помощта на двупосочните ANOVA множество измервания. Данните са представени като средно ± SEM. * * P & lt; 0,01, * * * P 13 се промени. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Дискусия
Стеатохепатитът има силна връзка с метаболитни нарушения като затлъстяване, инсулинова резистентност и дислипидемия 15. Няколко проучвания предполагат, че възпалението на мастната тъкан може да доведе до патогенезата на диабет тип 2, включително променен брой клетки както в вродената, така и в адаптивната имунна система 4, 5, 16, 17. Освен това е установено, че затлъстяването модулира активирането на имунните пътища, което може да доведе до чернодробни усложнения 18. Интересът към характеризиране на имунните клетъчни фенотипове при затлъстяване и възпаление на черния дроб нараства, тъй като всяка субпопулация от имунни клетки допринася по различен начин за развитието на инсулинова резистентност и стеатохепатит.
Този метод дава подробна информация за това как да се изолират и количествено определят относителните количества имунни клетки от перигонадната мастна тъкан и черния дроб. В допълнение, методите показват как мишки, хранени с HFD, могат да бъдат държани при несашеични условия, за да предизвикат стеатохепатит. Протоколът може да се използва за изследване на имунните клетъчни функции и за изследване на връзките на специфични имунни клетки между различни тъкани в микробиологично нормализирана среда.
В настоящото ни проучване, HRFD, хранещи мишки, които не са сепФ, доведоха до развитие на инсулинова резистентност и стеатохепатит, докато HFD SPF мишките развиха инсулинова резистентност, лека чернодробна стеатоза, но няма стеатохепатит, както се определя от имунохистохимията. В допълнение, подгрупите на мазнините и черния мухъл се различават значително между изложени на HFD и SPF мишки, което потвърждава нашето разбиране за важността на различните условия на живот. В заключение успяхме да покажем, че микробното излагане на общност може драстично да повлияе на имунологичните свойства на мишки C57Bl/6. Предишна работа показа, че разнообразието и функцията на чревния микробиом се влияе от свързаното с диетата затлъстяване 19, 20 и че чревната бариерна функция и чревната пропускливост зависят от условията на живот 21. В предстояща публикация искаме да разгледаме връзката между колонизацията на червата и възпалението на мазнините и черния дроб.
Има няколко точки, които трябва да се вземат предвид при планирането на предложените методи. Първо, всички анализи на поточна цитометрия изискват едноклетъчни суспензии и клетъчната жизнеспособност може да бъде повлияна от степента на механична дисоциация на тъканите и продължителността на тъканното смилане. За да се избегне унищожаването на ебегитопа на антителата и да се увеличи максимално добивът от функционално жизнеспособни, дисоциирани клетки, трябва да се има предвид видът на тъканите, възрастта на животното, генетичните промени, концентрациите на ензимите, температурата и времето на инкубация.
Второ, нашият протокол беше оптимизиран за количествено определяне на различни фенотипове на ударни клетки от затлъстели HFD-хранени мишки с възпаление на мастната тъкан и стеатохепатит. Тъй като броят на имунните клетки, броят на имунните клетки и по този начин качеството на храносмилането могат да бъдат повлияни от възпалителни процеси, използваният протокол и колагеназата трябва да бъдат оптимизирани за тъкани, различни от черния дроб или мастната тъкан в определени експерименти. По отношение на методите на дисекция, времето на инкубация или колагеназата, използвана за смилане на тъканта. На трето място, за протокола е важно всеки ден да участват различни експериментални групи, за да се елиминират ефектите от ежедневната промяна на анализа на поточната цитометрия (температура, време на инкубация и др.).
И накрая, ние предоставяме подробен протокол за фенотипната характеристика на мишата адипоза и чернодробните имунни клетки, използвайки поточна цитометрия в индуциран от диета животински модел на NASH и инсулинова резистентност. Предвид сложната функция и регулиране на вродените и адаптивни клетки, свързани със затлъстяването и метаболитната дисрегулация, предложените от нас методи трябва да помогнат за задълбочаване на разбирането ни за имунологичните механизми за балансиране на метаболитната хомеостаза. И така помогнете за разработването на човешки терапевтични средства, които могат да възстановят противовъзпалителните имунни отговори. Като цяло, предоставеният животински модел служи като бърз и стабилен модел за оценка на метаболитните усложнения, свързани със затлъстяването, и може да бъде приложен към други модели на болести.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.