Устна интубация на възрастни риби зебра Модел за оценка на приемането на биоактивни съединения в червата
Обобщение
Протоколът описва сондиране на възрастни данио с биологично; след това дисектирайте и подгответе цитометрия, конфокална микроскопия и qPCR на червата. Този метод позволява управлението на биоактивни вещества за проследяване на чревното поемане и предизвиквания локален имунен стимул. Важно е да се изследва чревната динамика на оралната профилактика.
Резюме
Въведение
В биомедицински контекст представлява интерес модел, разработен за тестване на биологичните ефекти на съединенията след орална интубация. Много от анатомичните и физиологичните особености на червата се запазват между двустранните линии с бозайници и костни риби 11. Този модел на устна интубация, свързан с анализа надолу по веригата, може да бъде инструмент за осигуряване на прозрения в човешката биология, както и поле за изпитване на биологични или други вещества in vivo.
Протоколът за орална интубация може да се извърши от един оператор, например успешно прилагане до 50 µL от суспензия на протеинови наночастици с тегло 1 g, с висока степен на оцеляване при риболов. Процесът е лесен за настройка и бърз; 30 риби могат да бъдат интубирани за 1 час. Протоколът за подготовка на червата е ключов за осигуряването на клетъчни проби и за последващ анализ. Примери за резултати надолу по веригата, които показват протокола, полезен за получаване на данни, свързани с чревното поемане и качествената РНК за изолат qPCR. Протоколът би бил от голяма полза за тези, които имат подходящ модел за тестване на динамиката на оралната профилактика или други съединения в червата.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
Всички експериментални процедури данио (Danio Rerio) са разрешени от етичния комитет на Universitat Autònoma de Barcelona (CEEH номер 1582) в съответствие с международните ръководни принципи за изследване върху животни (. EU 2010/63). Всички експерименти с живи данио се извършват при 26-28 ° С.
1. Подгответе оборудване за орална интубация
- Поставете около 1 см фина силиконова тръба върху 31 G игла за заключване на Luer, за да покриете върха на иглата.
- Изрежете 10 µL стерилен връх на пипетата на филтъра (приблизително 2 cm), вземете по-финия край и го поставете върху силиконовата тръба като капак. Уверете се, че върхът на иглата стърчи от пипетата, за да не нараните животното.
- Поставете иглата върху спринцовка Luer Lock от 100 µL.
ЗАБЕЛЕЖКА: Изплакнете с етанол и след това буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS, виж материали) задълбочено между леченията.
(2) необходимите решения
- Пригответе 150 mg/L (за анестезия) или 300 mg/L (за евтаназия) разтвор на етил 3-аминобензоат метансулфонат (MS-222) с вода от аквариума, където се грижат за зебра. Напълнете малък контейнер с 1 L разтвор за анестезия и го поддържайте проветрив.
- Напълнете още един малък контейнер с 1 L аквариумна вода без възстановяване на риби MS-222 и го поддържайте аериран.
- Направете 50 ml 1x PBS от 10x стерилен изходен разтвор.
- Анализ на цитометрия/изолирана чревна клетка Пригответе достатъчно пресен 0,15% разтвор на колагеназа тип IV за 1 ml на риба от изходен разтвор или прах в модифицирана среда на орел на Dulbecco (DMEM) с 1% V/V пеницилин и стрептомицин (виж материала). Направете аликвотни части (1 на риба) от 1 ml в 2 ml епруветки за центрофуги. Поддържайте темпо при 4 ° C до 30 минути преди дисекцията.
- За да фиксирате конфокалната микроскопия/проба, пригответе 50 ml пресен 4% разтвор на параформалдехид (PFA) с PBS буфер или размразете основен разтвор във фризер при -20 ° C в абсорбатор за пара.
Внимание: PFA е токсичен. Моля, прочетете информационния лист за безопасност, преди да работите с него. Трябва да се носят ръкавици и предпазни очила и винаги да се оставят разтвори в аспиратор.
3. Производство на флуоресцентна суспензия от наночастици
4. Обезболяване от риба зебра и орална интубация
5. Чревна дисекция на данио
7. Подгответе чревни криосекции за конфокална микроскопия
8. Подготовка на червата за qPCR в реално време (RT-qPCR)
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
Смесените полови рибки зебра (средно тегло: 1,03 ± 0,16 g) бяха успешно интубирани с различни рекомбинантни протеинови наночастици (тела за бактериално включване) с помощта на нашето домашно устройство за орална интубация (Фигура 1). Успешно извършихме орална интубация и постигнахме нисък среден процент на смъртност (6,8%) (маса 1). Zebrafish се интубират с 30 uL или 50 uL суспензии от наночастици и се изчислява смъртността в рамките на 24 часа след интубацията. Експериментите са били проведени от двама оператори, R е имал по-малко опит в боравенето с орална интубация на риба зебра в сравнение с J. Резултатите показват, че дори нов оператор може самостоятелно да извършва експерименти с орална интубация и лесно да постигне висока степен на оцеляване чрез този протокол. От нашия опит оптималният размер на рибата е 1 g, но ние успешно интубираме риба с размер до 0,5 g.
За да се разбере по-добре дали флуоресцентните наночастици IBs TNF eine (рекомбинантен цитокинов протеин, наноструктуриран като тела на включване) зебра се предават по нашия метод и се абсорбират в червата на зебра или не, извършихме анализ на цитометрията. Наночастиците (100 µg/риба, 50 µL) и PBS (контрол) се прилагат орално на данио (чрез интубация) и червата се дисектират на 5 h и 24 h след интубация. Общо чревни клетки се приготвят от стъпка 6 и се анализират чрез откриване на сигнала за емисия на флуоресценция. Представителните хистограми на интензивността на флуоресценцията и точковите графики на процента на флуоресцентните клетки са показани на фигура 2показани. Плътността на флуоресцентните клетки е значително по-висока в групата, интубирана с наночастици, в сравнение с контролната група за 5 часа и 24 часа (Фиг. 2А.). Процентите на флуоресцентните клетки са значително по-високи за 5 часа (46,3%) и 24 часа (43,0%) от групите, интубирани с наночастици (Фигура 2Б.).
За по-нататъшно проучване коя част от чревния слой участва в усвояването на наночастици, направихме анализ на конфокална микроскопия. Наночастиците (20 µg/риба, 50 µL) и PBS (контрол) се орално интубират върху зебра и червата се дисектират на 5 h след интубацията. Чревните секции бяха замразени тъканна процедура след стъпка 7(Фигура 3)подготвени. Конфокалните изображения на флуоресцентни наночастици в червата са показани на Фигура 3Б.показани. Флуоресцентните наночастици бяха открити в червата на данио. Наблюдавахме флуоресценцията в епителните клетки, ламина проприа и мускулните клетки.
За да проверим дали можем да извлечем висококачествена РНК чрез нашия протокол, анализирахме РНК, извлечена от червата, използвайки биоанализатор (наричан тук също РНК анализатор). Zebrafish са орално интубирани с PBS (50 µL) или наночастиците (20 µg/риба, 50 µL). Червата се дисектират за екстракция на РНК на 24 h след интубация. Имаме седем проби от РНК, които да тестваме с анализатора. Установихме, че всички тествани проби с РНК имат високи числа на целостта на РНК, вариращи от 7,9 до 8,9 (Фигура 4).
илюстрация 1 : Устно устройство за интубация. (А.) Изображение на 31 G игла Luer Lock върху спринцовка от 100 µL със силиконовата тръба и края на пипетата, фиксирани върху върха на иглата. (Б.) уголемена картина на иглената част. Черната стрелка показва, че върхът на пипетата надвишава края на върха на иглата. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.
Фигура 4 : Виртуалният гелов образ на РНК анализатор показва РНК, извлечена от 7 черва зебра, взети проби след интубация. Пробни номера 1 и 2 са групи от PBS интубирани, а пробни номера от 3 до 7 са интубирани от наночастици групи. Номерата на целостта на РНК (RIN) са дадени в долната част от 7,9 до 8,9. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.
| оператор | сила на звука | # Риба интубирана | Средно тегло (g ± SD) | # Смъртни случаи | Смъртност (%) |
| R. | 30 ΜL | 22-ри | 0,88 ± 0,14 | 3 | 13.6 |
| R. | 30 ΜL | 17-ти | 0,93 ± 0,19 | 0 | 0 |
| J | 50 ΜL | 19-ти | 1,23 ± 0,31 | 1 | 5.2 |
| J | 50 ΜL | 30-ти | 1,08 ± 0,40 | 2 | 6.6 |
| Всичко на всичко | 88 | 1,03 ± 0,16 | 6-то | 6.8 | |
| SD: стандартно отклонение на средната стойност | |||||
Маса 1: Сравнение на смъртността на данио, причинена от двама оператори, използващи протокола. Показват се идентификационният код на оператора, интубиран обем, брой риби и тегло на рибата в грамове (g).
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Дискусия
Този протокол е подобрение на описаната по-рано техника на орална интубация от Collymore et al. 4 от нашия протокол описва подробно метода на орална интубация и включва подготовката на червата за последващ анализ. Нашият метод подобрява скоростта на манипулация на рибата, така че един човек може да изпълни целия протокол бързо и без много различия между операторите. Основна разлика от нашия протокол с предишния е, че ние оценяваме успеха на експеримента за орална интубация не само чрез наблюдение на животното за благосъстояние (напр. Без кървене) и за липса на изтичане на приложената течност, но и чрез проверка на приема на биоактивни наночастици в червата с последващ анализ (цитометрия, конфокална микроскопия и qPCR). Ние показваме, че интубирани с пенетрант маркирани наночастици са открити в червата.
Ограниченията на нашето проучване са размерът на рибата, тъй като не сме тествали приложението при риби, които са по-малки от 0,5 g, и използването на химически анестетик за успокояване на животните. Някои автори използват студена вода (0-4 ° C), за да обезболят зебрата, но от хуманно отношение към животните и европейска правна перспектива решихме, че MS-222 ще бъде избраният метод.
Рибата зебра предлага много предимства пред други моделни системи, включително пълен набор от генетични данни и наличните трансгенни линии. За имунолозите трансгенните линии (напр. SF Mpx: GFP и Tg Mpeg1: GFP) създават сцена за in vivo наблюдение на имунни клетки като Макрофаги и неутрофили 19, 20. Комбинирането на нашата орална интубация и анализ надолу по веригата с трансгенни линии би било идеално за идентифициране на видовете клетки, участващи в усвояването, транспортирането и обработката на орални ваксини, наночастици и патогени в рибите.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Разкриване
Авторите заявяват, че няма конфликт на интереси.
Благодарности
Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от испанското министерство на науката, Европейската комисия и средствата на AGAUR за NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER и 2014SGR-345 AGAUR). RT притежава докторантска субсидия от AGAUR (Испания), JJ беше подкрепена от докторска субсидия от Китайския съвет за стипендии (Китай), а NR се основава на програма Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Благодарим на Dr. Torrealba за компетентни съвети в производството на протеини, N. Barba от „Servei de Microscopia“ и Dr. М. Коста от "Servei de Citometria" на Universitat Autònoma de Barcelona за полезна техническа поддръжка.