Управителен съвет проф.

От Медицинска клиника за дребни животни, Катедра по вътрешни болести на малки домашни любимци и домашни любимци от Ветеринарния факултет на Университета Лудвиг Максимилианс в Мюнхен. Катрин Хартман Произведено под ръководството на проф. Д-р Катрин Хартман Генетични и хранителни фактори в развитието на захарен диабет при кучета: Изследвания върху полиморфизмите в четири кандидат-гена и на предлагането на витамин D Встъпителна дисертация за получаване на ветеринарна докторска степен от ветеринарния факултет на Университета Лудвиг Максимилианс в Мюнхен, представена от Янис Уриг от Карлсруе Мюнхен 2007

Отпечатано с одобрението на Ветеринарния факултет на Ludwig-Maximilians-Universität München Декан: Лектор: Съ-рефер: Унив.-проф. Д-р E. P. Märtlbauer Univ.-Проф. Д-р Хартман проф. Д-р Д-р Голдбърг: 20 юли 2007 г.

Ние знаем какво кара цветята да растат, но не знаем защо всички имаме знания за ДНК, но все пак умираме Джъстин Съливан Декларирането на съмнение като философия на живота е като избора на застой като транспортно средство Ян Мартел В памет на моята майка

4.5. Измерване на 25 (OH) нива на витамин D 3. 61 4.6. Измерване на 1,25 (OH) 2 нива на витамин D 3. 62 V. Дискусия. 64 1. Сравнение на методите за генотипиране. 64 2. Етиология на захарния диабет при хора и кучета. 65 2.2 Генетични фактори за развитието на захарен диабет. 65 2.3 Състояние на витамин D като хранителен фактор за развитието на диабет. 68 3. Ограничения на това проучване. 69 3.1. Номер на животното. 70 3.2. Колектив от пациенти. 70 3.3. Контролна група. 71 3.4. Уча дизайн. 72 4. Уместност на настоящото изследване. 72 5. Outlook. 73 VI. Обобщение. 76 VII. VIII. Резюме. 78 Библиография. 80

Азбучен списък на съкращенията 7-DHC: 7-дехидрохолестерол ADA: Американска диабетна асоциация ВЪЗРАСТ: напреднал гликозилиран краен продукт ALP: аланин-аминотрансфераза AP: алкална фосфатаза APC: антиген-представяща клетка ARMS: система за усилване на огнеупорни мутации CTLA4: Цитотоксична T-лимфна цитоксика: Циклов праг DDG: Германско общество за диабет DKA: Диабетна кетоацидоза DLA: Кучешки левкоцитен антиген D. m.: Захарен диабет EDTA: Етилендиаминтетраоцетна киселина EPI: Екзокринна панкреатична недостатъчност GAD65: Глутамат човешка декарбоксилаза GH: Растежен хормон HGV Варианти на растежен хормон HVG Левкоцитен антиген IA-2/ICA-512: Тирозин фосфатаза IBD: Възпалително заболяване на червата ICA: Антиген на островни клетки IDD: Инсулинодефицитен диабет IDDM: Инсулинозависим захарен диабет IFN-γ: Интерферон-γ IL-2: Интерлевкин-2 IRD: Инсулиноустойчив диабет ISAG: Международно дружество за генетика на животните LADA: Латентен автоимунен диабет при възрастни LYP: Лимфоиден-тирозин-фосф атаза MHC: Основен комплекс за хистосъвместимост MODY: Диабет с зряла поява на младите МС: Мултиплена склероза

NADPH: намален никотинамид аденин динуклеотид NIDDM: неинсулинозависим захарен диабет NO: азотен оксид ИЛИ: коефициент на шанс NPH: изофан-инсулин PCR: полимеразна верижна реакция PP: панкреатичен полипептид PTH: паратиреоиден хормон PZI: протамин-цинк-инсулин RXR: Ретиноиден X рецептор SD: стандартно отклонение SNP: единичен нуклеотиден полиморфизъм T1DM: захарен диабет тип I TBE: TRIS-борат-EDTA TE: TRIS-EDTA TGF-β: трансформиращ растежен фактор β TNF-α: фактор на туморна некроза-α VDR: витамин D- VDRE рецептор: Витамин D реагиращи елементи VIP: Вазоактивен чревен полипептид VUW: Университет по ветеринарна медицина, Виена СЗО: Световна здравна организация

II. Преглед на литературата 4 Електронният микроскоп хомогенно непрозрачен, малки гранули се съхраняват и съставляват около 5% от островните клетки. Най-малката и много хетерогенна група ендокринни панкреатични клетки, PP клетките, секретират гастроентеропанкреатични полипептидни хормони, например панкреатичния полипептид (PP) или вазоактивния чревен полипептид (VIP). Ендокринните клетки на панкреаса са заобиколени от гъста мрежа от фенестрирани капиляри и освобождават секрета си в кръвта чрез екзоцитоза. Те не могат да бъдат разграничени от оцветяването с хематоксилин-еозин, но могат да бъдат идентифицирани много добре чрез имунохистохимичното оцветяване на хормоните, които произвеждат (MOSIMANN & KOHLER, 1990; SINOWATZ, 2000; BÖCK & LIEBICH, 2004). 1.3. Инсулин Инсулинът е пептиден хормон с голяма хомология между различните видове бозайници. Кучешкият инсулин е идентичен по своята последователност с инсулин от свине (www.ebi.ac.uk/swissprot). Той действа чрез своя рецептор както върху глюкозната хомеостаза, така и върху метаболизма на мазнините, протеините и кетонните тела. 1.3.1. Образуване на инсулин и секреция на инсулин Инсулинът се образува като пре-про-инсулин в ß-клетките на панкреаса и при кучета се състои от 106 аминокиселини, които образуват сигнална последователност, както и А и В верига, която е свързана чрез междинна връзка, така наречената C- Пептид, който трябва да бъде свързан. Проинсулинът от 82 аминокиселини се образува чрез разделяне на сигналната последователност и образуване на три дисулфидни моста. В по-нататъшния ход на процеса С-пептидът се отделя и полученият инсулин, който при кучета се състои от 51 аминокиселини (SMITH, 1966), свързан с цинков йон като хексамер, се съхранява в гранули на клетъчната повърхност и като реакция на повишаване на нивата на кръвната захар се съхранява заедно с C- Пептидът се секретира в кръвта в еквимоларни количества. Тъй като образуването на инсулин от неговите предшественици чрез така наречените прохормонови конвертази се извършва само в гранулите за съхранение, ако секрецията на инсулин е бърза, проинсулинът също се освобождава в кръвния поток; обаче има малка биологична активност. Освен това, различни протеини от гранулите попадат в циркулацията. На повечето се приписва роля за установяване на оптимални условия за съхранение и обработка на инсулина. Не може да се изключи обаче, че някои от тях могат да проявяват и биологична активност. Едно

II. Преглед на литературата 8, както и стесняване на капилярите в гломерула и ретината. Тази биохимична реакция вероятно допринася за голяма част от известното и опасяващо се дългосрочно увреждане на D. m. като атеросклероза, диабетна нефропатия и диабетна ретинопатия в (VLASSARA et al., 1986). Тъй като всички тези усложнения се развиват само в продължение на няколко десетилетия, те са клинично по-малко важни за кучето (FELDMAN & NELSON, 2004). Дългосрочните последици от D. m. са описани в раздел 1.6.3. справям се с. При нормални нива на кръвната захар само около 3% от глюкозата се разгражда по така наречения път на сорбитол от ензима алдоза редуктаза до сорбитол и накрая до фруктоза. В хипергликемично състояние тази стойност се увеличава до 30%. Тъй като NADPH (редуциран никотинамид аденин динуклеотид) се консумира по време на разграждането на глюкозата по полиинозитоловия път, в клетката възниква дефицит на NADPH. NADPH е субстрат за глутатион пероксидаза, който предпазва клетката от свободни радикали и по този начин от увреждания, причинени от оксидативен стрес. По този начин повишената активност на алдозна редуктаза, за която се подозира, че участва в образуването на AGEs, може да увреди съдовите ендотели и по този начин да доведе до усложненията на D. m. допринасят за хората (SRIVASTAVA et al., 2005). Тези механизми изглежда съществуват и при кучешки D. m. от второстепенно значение поради късата продължителност на живота на кучето, обаче, изглежда, че пътят на сорбитола играе важна роля за формирането на диабетна катаракта както при кучета, така и при хора (LIGHTMAN, 1993; WILKIE et al., 2006). 1.5. Епидемиология на кучешкия диабет Според американско проучване, което ретроспективно е разгледало разпределението на породите кучета с D. m. в сравнение с породата разпределение на кучета, представени в същата клиника по други причини, дванадесет породи са имали особено висок риск да имат D. m. да се развиват (австралийски териер, среден шнауцер, самоед, миниатюрен шнауцер, фокс териер, Keeshond, Bichon Frize, Finnenspitz, Cairn Terrier, миниатюрен пудел, сибирски хъски, играчка пудел). По-голямата част от кучетата са били на възраст между пет и десет години по време на диагностицирането; D. m. Имат най-голямо разпространение. във възрастовата група между единадесет и 15 години (GUPTILL et al., 2003).

II. Преглед на литературата 10 1993). Хиперлипидемията е лабораторна находка, която често може да се наблюдава, тъй като повишената липолиза в кръвта води до повишени нива на свободни мастни киселини, когато липсва инсулин. Хиперлипидемията води до увеличено съхранение на мазнини в черния дроб и по този начин до чернодробна липидоза (JAMES & DAY, 1999). Това води до повишаване на активността на чернодробните ензими алкална фосфатаза (AP) и аланин аминотрансфераза (ALT). В проучване с 208 кучета с D. m. 90% от всички кучета показват увеличение на активността на AP и 78% увеличение на активността на ALT, при 42% от кучетата серумът е липемичен (HESS et al., 2000). 1.6.2. Основни заболявания Хормонални влияния, лекарства и заболявания на панкреаса и други органи могат да доведат до D. m. да води. По принцип D. m. обратим и в тези случаи, в които има хиперадренокортицизъм или повишена нужда от инсулин в диострусите, преходът от преходен към трайно проявен D. m. понякога може да бъде постигнат чрез навременно лечение на основното заболяване или незабавна кастрация. да се избягва. В повечето случаи обаче твърде много β-клетки вече са загинали в резултат на глюкозна токсичност или изчерпване на капацитета им за секреция, за да се поддържа достатъчна секреция на инсулин, така че обратимият D. m. става необратим диабет с дефицит на инсулин (FELDMAN & NELSON, 2004; NORMAN et al., 2006). 1.6.2.1. Остър и хроничен панкреатит Острият или хроничният панкреатит са често срещани заболявания, които унищожават ендокринните клетки на панкреаса и по този начин водят до липса на секреция на инсулин; неоплазмите на екзокринния панкреас се появяват рядко (ALEJANDRO et al., 1988). Острият панкреатит има тенденция да води до бързо унищожаване на β-клетките и по този начин до липса на секреция на инсулин, докато хроничният панкреатит е най-важната причина за инсулинова резистентност, свързана с възпалението (FELDMAN & NELSON, 2004). 1.6.2.2.Хиперадренокортицизъм Глюкокортикоидите, произведени от организма или доставени ятрогенно, водят до повишаване нивото на кръвната захар чрез повишена гликогенолиза и глюконеогенеза. По този начин те действат като инсулинов антагонист и по този начин могат да доведат до D. m. да води. Освен това, глюкокортикоидите водят до a

II. Преглед на литературата 14 микроалбуминурия, има повишено производство на трансформиращ растежен фактор β (TGF-β). Този растежен фактор е отговорен за повишено извънклетъчно отлагане на матрични протеини в гломерула; това води до удебеляване на базалната мембрана и разширяване на мезангия (SCHENA & GESUALDO, 2005). Тъй като продължителността на началната фаза е около пет години и диабетната нефропатия е напълно развита едва след около 20 години, тя се появява много рядко поради по-кратката продължителност на живота на домашните кучета (STRIPPOLI et al., 2003; FELDMAN & NELSON, 2004). 1.6.3.6 Диабетна кетоацидоза DKA е животозастрашаващото дерайлиране на метаболизма на тялото поради нелекувана или лошо контролирана D. m., Характеризираща се с биохимичната триада на хипергликемия, ацидоза и кетоза. Както вече беше описано, липсата на инсулин и глюкоза в периферните клетки на тялото води до повишена липолиза и образуване на кетонни тела в черния дроб, тъй като свободните мастни киселини се окисляват до ацетил-КоА, който не се добавя към цикъла на лимонената киселина поради липсата на глюкоза в клетката може да бъде и се метаболизира до слабите киселини ацетон, ацетоацетат и β-хидроксибутират. Този ефект се засилва от повишените концентрации на инсулинови антагонистични хормони (особено глюкагон и глюкокортикоиди) и повишената глюконеогенеза и гликогенолиза водят до по-нататъшно повишаване на нивата на кръвната захар. Това води до осмотична диуреза, загуба на електролити и дехидратация (SONKSEN & SONKSEN, 2000; GOODMAN, 2003). Кетонните тела могат да се използват от много телесни клетки, включително тези в мозъка, за генериране на енергия, но ако се образуват в излишък, те допринасят за сериозното дерайлиране на метаболизма на организма. Те действат като слаби киселини и следователно водят до изчерпване на буферните системи в кръвта и по този начин до метаболитна ацидоза. Те се филтрират свободно през гломерула и поради хидрофилността си усилват осмотичната диуреза. Поради отрицателния заряд на кетонните тела, катиони като натрий и калий, но също така калций и магнезий се секретират от кръвта в урината, за да се поддържа електронеутралността на кръвта. Това води до изчерпване на натрий и калий в организма и по-нататъшно тежко обезводняване. Ако няма приток на глюкоза в телесните клетки, никой калий не може да попадне в клетката, тъй като това може да стане с помощта на

III. Материали и методи 40 или са били насочени към клиниката от общопрактикуващите лекари само когато са възникнали усложнения. 1.1.3. Раса и разпределение по пол 13 кучета са смесени породи; най-често представените породисти кучета са дакели, бял териер и пудели в Западна планина (по четирима пациенти) и немски овчарки (трима пациенти, виж таблица 2). Най-често бяха представени малки породи териери (Уест Хайленд Уайт Териери, Йоркширски Териери, Джак Ръсел Териери, както и Уелски Териери и Скоч Териери с общо десет пациенти). Породите кучета от Медицинската клиника за малки животни в Мюнхен са изброени отделно в раздел 3, за да могат да се сравняват с най-често срещаните породи от цялата популация пациенти в Медицинската клиника за дребни животни през периода на проучването. 28 кучета с D. m. са били жени, от които 15 кастрирани и 13 не кастрирани, 23 кучета с D. m. са били мъже, единадесет от тях кастрирани и дванадесет не кастрирани. Таблица 2: Най-често срещаните породи кучета със захарен диабет (цяла популация на изследване) Порода Брой смесени породи 13 Дакел 4 Пудел 4 Западнопланински бял териер 4 Ротвайлер 3 Немска овчарка 3 Йоркширски териер 2 Джак Ръсел Териер 2 Други 16

III. Материали и методи 50 усилване. Тъй като ефективността на свързване на праймерите е различна, стойностите на Ct се различават въпреки еднаквото количество ДНК в различните алели, така че Ct 1C) трябва да се различава в температурата си на топене. Оптималната температура на отгряване и концентрацията на специфичните за алела праймери трябва да бъдат оптимизирани в няколко предварителни теста (LINDBLAD-TOH et al., 2005). Функциониращ подход може да бъде установен само за един от ОНП; праймерите и реакционните условия са дадени в табл. PCR се провежда върху 96-ямкови плаки (Thermowell Gold PCR Plates, Corning Inc., Corning, USA) с AB 7300 термоциклер (Applied Biosystems, Foster City, USA). PCR беше последван от етап на дисоциация, при който температурата на топене на PCR продуктите беше определена, използвайки температурен градиент (60-95 ° С). Или първото отрицателно производно на кривата на флуоресценция показва пик при по-ниската температура на топене, след това по-късият ампликон се усилва и пробата съдържа аденин или тимин на мястото на SNP, или пик с по-висока температура, тогава пробата е хомозиготна за гуанин или цитозин. Хетерозиготните животни показват два пика, по един пик при съответната температура. Грундовете са получени от Operon Biotechnologies GmbH в Кьолн, Германия. Използва се Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, USA). За да може да се сравни този нов метод за генотипиране с ARMS-PCR, SNP V7 беше генотипиран, използвайки и двата метода.

III. Материали и методи 55 Таблица 9 SNP V7 Крива на топене PCR; Праймер, PCR програма, реакционна партида, отпечатана с получер шрифт: Базов обмен Праймер 1 (специфичен за алела) GCGGGCAGGGCGGCCCTGGCTAGCCCTGAC Праймер 2 (специфичен за алела) GCGGGCCCTGGCTAGCCCTGAT общ праймер AGTCAGGTGCCCTCCTCCTTTGG Cycle start 60 сек синтез 72 C 30 сек партида H 2 O 7,8 µl (20 µl) грунд 1 (10 µm) 0,4 µl праймер 2 (5 µm) 0,4 µl общ праймер (10 µm) 0,4 µl 2x SYBR-Green Mastermix 10 µl ДНК-шаблон 1 µl 2.8. Статистика Статистическата оценка е извършена със SPSS за Windows, версия 13.01 (SPSS Inc., Чикаго, САЩ). Несдвоеният t-тест на Student е използван за сравняване на средните стойности на витамин D, а тестът χ 2 за сравняване на честотите на алелите. Р от 0,05 се счита за значимо. Анализът на силата на теста и необходимия брой животни беше извършен с Power And Precision (Biostat Inc., Englewood, САЩ).

IV. Резултати 56 IV. Резултати 1. Секвениране Праймерни двойки бяха създадени за общо 18 секции от гените на VDR, CTLA4, LYP-PNP и DLA, секциите бяха амплифицирани с помощта на PCR и пречистената, реплицирана ДНК беше секвенирана. Двойките праймери бяха избрани така, че да се усилват колкото се може повече части от всички екзони и границите екзон-интрон. 1.1. Последователност на рецепторния ген на витамин D Когато бяха сравнени секвенираните генни сегменти, в гена VDR бяха открити седем SNP, три от тях в интрони, три в екзони и един в нетранслиран 5 регион (фиг. 1). Фиг. 1: Полиморфизми с единичен нуклеотид (стрелки) в рецепторния ген на витамин D (кодиращи области (екзони), показани със сиви кутии) 1.2. Секвениране на гена на цитотоксичния Т лимфоцитен антиген 4 В гена CTLA4 бяха открити два SNP, един в екзон 2 и един в екзон 4 (ФИГ. 2). Фиг. 2: Еднонуклеотидни полиморфизми (стрелки) в цитотоксичния ген на Т лимфоцитния антиген 4 (кодиращи области (екзони), показани със сиви кутии)

IV. Резултати 57 1.3. Секвениране на лимфоидния тирозин фосфатазен ген A SNP е намерен в гена LYP, той се намира в екзон 13 и води до аминокиселинен обмен (фенилаланин> левцин). Фигура 3: Еднонуклеотидни полиморфизми (стрелки) в гена на лимфоидната тирозин фосфатаза (кодиращи области (екзони), показани със сиви кутии) изброени в раздел 10. Таблица 10 Локализация на единичните нуклеотидни полиморфизми (SNP) (UTR = нетранслиран регион, AS-Aust. = Аминокиселинен обмен, PPA = Primer-Probe-Assay, ARMS = Amplicon Mutation Refractory System-PCR, TM = Melting Curve-PCR, Phe = Phenylalanine, Leu = левцин) SNP регион ген AS-Aust. PCR V1 c.-21t> c 5 'UTR VDR - PPA V7 c.501 + 3310A> G Intron 3 VDR - ARMS/TM V8 c.501 + 3434c> t Intron 3 VDR - ARMS V9 c.533c> t Exon 4 VDR - секвениран V10 c.677t> c exon 5 VDR - ARMS V11 c.761t> c exon 5 VDR - ARMS V13 c.1150 + 1580a> g intron 7 VDR - ARMS C1 c.372c> t exon 2 CTLA4 - PPA C2 c.958a> g exon 4 CTLA4 - ARMS LYP c.2344a> t exon 13 LYP-PNP Phe> Leu PPA