Universitätsklinikum Hamburg - Eppendorf - PDF безплатно изтегляне
Университетски медицински център Хамбург - Център за експериментална медицина Eppendorf Институт по молекулярна клетъчна биология Директор: проф. Д-р обратно Физиол. Д-р H. ° С. Ulrike Beisiegel За механизма на хепатомегалията при заболявания с претоварване с желязо. Изследване на генната експресия в модел на животно от плъх Дисертация за получаване на степен ДОКТОР МЕДИЦИНА на медицинския факултет на Хамбургския университет Хамбург - Епендорф, представена от: Ehsan Khaljani роден. в Техеран/Иран Хамбург 2010
Приет от медицинския факултет на: 25.10.2010 г. Публикуван с одобрението на медицинския факултет на Хамбургския университет Научен надзор: PD Dr. Д-р Peter Nielsen Audit Committee, председател: проф. Д-р Д-р Изпитателен съвет на Ulrieke Beisiegel: 2-ри рецензент: PD Dr. Д-р Петер Нилсен Изпитна комисия: 3-ти рецензент: проф. Д-р Р. Бьогер - 1 -
Съдържание 1. Въведение Метаболизъм на желязото 5 Медицинско значение на желязото 12 Черен дроб: функция и физиология 16 Увеличаване на черния дроб 17 Описание на животинския модел и значението на мастната група 18 Принцип на претоварване с желязо с TMH Ferrozen 19 Хистология 20 Промени в генната експресия в животинския модел на плъхове 20 Въпрос 27 2. Експерименти (материал и методи) Сонографско изследване на обема на черния дроб 28 In vivo определяне на концентрацията на чернодробно желязо с SQUID 29 Статистическа оценка на данните за пациента 30 Модел на животни от плъхове с TMH, замразени 32 Отстраняване на черния дроб 33 Определяне на концентрацията на желязо в плъхове in vitro 34 Хистологична обработка на черния дроб на плъховете 35 Изолиране на ДНК, протеини и РНК за rt rt PCR 36 РНК гел електрофореза 38 Транскрипция на РНК в cdna 40 Генериране и подреждане на праймерите 41 Провеждане на rt rt PCR 44 Статистическа оценка на rt rt PCR данните 45 ДНК гел електрофореза 49 Провеждане на Western blots с p-акт 5 0-3 -
3. Резултати Статистическа оценка на данните за пациента 51 Обем на черния дроб на плъх 53 Определяне на концентрацията на желязо в черния дроб на плъхове 54 Хистологична обработка на черния дроб на плъхове 55 Тегло на черния дроб на плъх 56 Оценка на rt rt PCR и резултатите от Western blots 57 ДНК гел електрофореза 68 4. Дискусия Дискусия на данните за пациента 69 Дискусия на Хистология 70 Дискусия на данните от rt rt PCR и Western blots 71 Заключение 77 5. Резюме 80 6. Списък на съкращенията 82 7. Източници и референции 83 8. Приложение (добавки) rt rt PCR криви 88 ДНК гел електрофореза 88 Общ файл за хранене 92 9. Благодарности 93 10. CV 94 11. Декларация 96-4 -
Фиг.2 Желязото навлиза в тялото по два начина. Или чрез HCP1 под формата на хем, или като редуцирано растително желязо чрез DMT1. С помощта на хем оксигеназа желязото се освобождава от хема. Според Donovan et al (Physiology 21: 115-123,2006) Тук той се превръща обратно в своята тривалентна форма от Hepheestin, ферооксидаза, съдържаща мед, с цел промяна на нейната разтворимост и накрая, свързан с трансферин, доведен до местоназначението си (11). Фиг.3: Положение на хефестин върху базолатералната стена на ентероцитите. Тук желязото се превръща в неговата тривалентна форма и се свързва с трансферин. Мутация на ферропортин при автозомно доминираща хемохроматоза: загуба на функция, печалба в разбирането, Fleming et al (2001) - 7 -
Същото се отнася и за трансфериновия рецептор. Фиг.6 Железо-регулаторните протеини се свързват с 3-ия край на иРНК на трансфериновия рецептор към характерната структура на стволовия цикъл и по този начин осигуряват намалено разграждане на мрна (малко разграждане). Според Sanchez et al (2006) Чрез този механизъм желязото се включва в железно-сярния клъстер на IRP1 (IRP1 се отделя от IRE), така че поглъщането на желязо се намалява поради намалената експресия на DMT1 и описаният по-горе цикъл може да започне отново . Показаното регулиране обаче може да се осъществи и в нетранслирания край на мрна, където може да се наблюдава противоположен ефект, т.е. ограничение в транслацията (21,22). Фиг.7 IRP се свързват с 5-ия край на феритиновата иРНК и по този начин предотвратяват транслацията на мрна. Според Sanchez et al (2006) - 10 -
Междувременно са известни много гени, носещи IRE мотиви, които дори могат да бъдат успешно идентифицирани биокомпютърно без масиви. Biocomputional означава, че мотивите се записват със специален софтуер за компютърно търсене, базиран на известните mrna последователности в PubMed. Фигура 8 Представяне на IRE-носещи гени, които са били идентифицирани по биокомпулация. Регулиране на желязото и клетъчния цикъл, M Sanchez et al., J Biol Chem.2006 август 11; 281 (32): 22865-74. Epub 2006 7 юни След като абсорбираното желязо се транспортира в целевата клетка чрез трансферин, желязото се съхранява във феритина като полимерен железен оксид-хидроксид-фосфат. Фиг.9 Това изображение на феритина, получено чрез рентгенова кристалография, показва съхранението на минералното желязо в центъра на феритиновата сърцевина (кафяво). Според Casidy et al. 2004 г. Феритинът е в състояние да освободи желязо от запасите или да продължи да съхранява желязо, в зависимост от нуждите на организма. - 11 -
Фиг.11: Принцип на липидната пероксидация и нейните последици Според Nielsen et al (2006) са известни много други клинични картини във връзка с претоварване с желязо, въпреки че тежестта на симптомите зависи от съответната генетична вариация. Миокардиоцитите съхраняват желязо, което води до токсична миокардна фиброза. В панкреаса хемохроматозата може да доведе до панкреатична фиброза с плуригландуларна недостатъчност, което може да доведе до вторичен захарен диабет. Това се нарича още бронзов диабет поради съществуващата свръхпигментация на кожата. Сидерозата на плазмените клетки, която се характеризира с грубо интрализозомно отлагане на желязо близо до ядрото, често може да бъде диагностицирана в костния мозък (28). Във всички случаи железните отлагания се откриват от класическия пруски син цвят. Болестният комплекс хемохроматоза е разделен на четири подформи. Симптомите и тежестта се различават по сила. Хемохроматозата тип 1 е най-често срещаната подформа в западния свят (29) и също е обект на проучвания на пациенти в тази докторска дисертация. - 14 -
Чернодробно желязо (mg/g чернодробно тегло) 35 30 25 20 15 10 5 0 Концентрация на чернодробно желязо с TMH-Замразено хранене H мохроматоза 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 време за хранене в седмици Фиг. 14 Фигурата показва хода на съхранението на желязо в черния дроб в mg/g чернодробно тегло спрямо продължителността на храненето. С увеличаване на времето за хранене се достига плато в количеството желязо в черния дроб. Nielsen 2006 1.7. Хистология Предишните изследвания все още не са успели да изяснят дали черният дроб, увеличен от претоварване с желязо при плъхове, е бил хипертрофиран или е нараснал в обем поради разпространението. Все още не е изключено и възпалението. 1.8. Промени в генната експресия в модела на плъхове На базата на предположението, че претоварването с желязо и мазнини би довело до вариации в генната експресия, беше изследвана транскрипцията на представителни маркери за въпросните метаболитни пътища (Фигура 15), които ще бъдат разгледани по-подробно по-долу. Фиг.15 Черният дроб в центъра на различните метаболитни процеси - 20 -
Фиг. 17 IGF-1 като част от оста на хипоталамусната хипофиза черен дроб-кост. IGF-1 е пряко повлиян от растежния хормон и е медиатор на хипертрофия. Източник: http://www.mfi.ku.dk Протеините носители (IGF-BP 1-6 = Инсулин като растежен фактор - свързващ протеин) се свързват с плазмата, след като IGF-1 е секретиран и също са под хормон на растежа и контрол на инсулина. Тези хормони определят кога IGF1 може да се отдели от своите свързващи протеини, да премине към активната форма и накрая да се свърже с неговия рецептор (IGF-R = инсулиноподобен рецептор на растежен фактор). Със своята тетрамерна структура и вътреклетъчна активност на тирозин киназа, IGF-R прилича на инсулиновия рецептор и позволява на IGF-1 да инициира вътреклетъчни сигнални каскади. След това резултатът от сигналната последователност е повишена протеинова биосинтеза, инхибиране на протеолизата, включване на тимидини в ДНК и включване на сулфати в протеогликани (24). Влиянието на маркерите за хипертрофия също се проследява на ниво протеин. Фосфорилирането на AKT-1 се разглежда с Western blots. - 24 -
Фиг. 18 IGF-1 и AKT сигналния път са пряко свързани в антиапоптотични пътища. Източник: www.biocarta.com, модифициран от Khaljani 2008 AKT-1 е протеин киназа за различни сигнални каскадни пътища (като апоптоза, процеси на клетъчния цикъл, анигиогенеза), но AKT-1 е пряко свързан с IGF-1. По този начин AKT-1 медиира антиапоптотичния ефект на IGF-1, като го увеличава. Хипертрофия без повишен AKT-1 може до голяма степен да бъде изключена, тъй като тя е и централен медиатор в хипертрофичните пътища. Все още трябва да се вземат предвид различни фактори, влияещи върху желязото върху ACT, тъй като желязото като вредно средство се намесва в различни метаболитни пътища. Гени на възпалението Прекомерният клетъчен растеж може да има и други причини освен пролиферацията и хипертрофията. В този контекст е възможно разширяване на черния дроб в хода на възпалителен процес, което искахме да наблюдаваме, като разгледаме маркерите за възпаление. Провъзпалителният маркер, цитиран класически в литературата, е TNF-a (фактор на туморна некроза-a), който следователно също избрахме за нашето изследване. - 25 -
1.9. Въпрос В настоящото проучване трябва да се отговори на следните въпроси: 1. Води ли претоварването с желязо до хепатомегалия при хората, както при плъховете? 2. Възможно ли е уголемяването на черния дроб при пациенти в пряка зависимост от концентрацията на желязо в черния дроб? 3. Кои гени играят роля при индуцираното от желязо уголемяване на черния дроб при плъхове: пролиферация, хипертрофия или възпаление и какво показва хистологията? 4. Претоварванията с желязо и мазнини причиняват ли подобни реакции на генната експресия и на протеиновото ниво? - 27 -
2. Експерименти (материал и методи) 2.1. Сонографско изследване на обема на черния дроб Материал: - Ултразвуково устройство: Picker CS 9500 - Ултразвуков контактен гел: Цезар и Лориц - Вакуумен матрак: Vac Fix As - Подвижен диван За определяне на обема на черния дроб, пациентите лежат по гръб, така че черният дроб под ребрената дъга да бъде достигнат възможно най-лесно печалба. След това бяха направени ултразвукови изображения в сагиталната равнина с помощта на ултразвуковата глава под лазерен контрол на разстояние 2 cm. Чернодробната област трябваше да бъде маркирана ръчно върху изображенията и умножена по дебелината на резена от 2 cm. След сумиране на резултатите от 8-секционните изображения обемът на черния дроб беше приблизително. Работата е извършена с любезната подкрепа на г-н Райнер Енгелхард и Роланд Фишер от клиниката за метаболизъм на желязо на Центъра за женска и детска медицина, клиника и поликлиника f. Детска хематология и онкология, Университетска болница Eppendorf. Фиг. 19 Извлечение от досието на пациента. Отбелязват се идентификационният номер (ID), полът (полът), мутацията на хемохроматозата (C282Y, H63D), диагнозата, теглото, височината, както и измереният обем на черния дроб (Vol-liv) и концентрацията на чернодробно желязо (LIC) - 28 -
Gs a (алфа субединица на стимулиращ G протеин) също беше първоначално измерена, което показа сравними данни. Въпреки това, GAPDH се оказа по-надежден в практическата работа, така че експресията на целевите гени беше свързана с GAPDH. 3.7. ДНК гел електрофореза Снимките на ДНК геловете могат да бъдат намерени в приложението. Изображенията се използват за проверка на rt PCR за нежелани странични продукти и замърсяване. ДНК гелът може също да се използва, за да се определи дали очакваният продукт има подходящия размер, който може да се провери с помощта на стълба от 100 bp в лявата част на картината. Първата, долна лента на стълбата означава 100 bp, втората за 200 bp и т. Н. Тъй като бяха използвани само грундове, които показаха чисти PCR продукти в гела в тестовия цикъл, само една ясна лента може да се види във всички гелови изображения на съответното ниво. Количеството зависи от амплифицирания размер на ДНК, който е отбелязан в списъка с праймери. PCR контролът показва правилния размер на PCR продукта във всички изображения и е отрицателен за замърсяване. - 68 -