Терапевтично прескачане на екзон за дисферлинопатии европейско списание за човешка генетика

  • Теми
  • Резюме
  • Въведение
  • Методите
  • База данни
  • AON
  • Клетъчна култура и трансфекция
  • РНК анализ
  • Резултати и дискусия
  • Скачане на екзон за дисферлин
  • Приоритизирайте DYSF екзоните
  • Възможност за пропускане на екзон на DYSF
  • Заключителни бележки

Теми

  • Алтернативно снаждане
  • Антисенс елементи
  • Невромускулно заболяване
  • Поправка на тази статия е публикувана на 19 август 2010 г.

Резюме

Въведение

Мускулна дистрофия на крайника на пояса от тип 2B (LGMD2B), миопатия на Myoshi (MM) и дистална миопатия с предно тибиално начало (DMAT) са заболявания на автозомно-рецесивния алелен мускул, причинени от мутации в DYSF гена, кодиращ дисферлин, водещи до тежка или пълна липса на протеинът дисферлин. 1, 2, 3 Повечето пациенти имат малки мутации: Мутациите при спиране на рамката или смяна на рамки водят до преждевременно отсечени протеини, докато мисенс мутациите обикновено влияят на стабилността на протеините. 4 Повече от 100 различни мутации са докладвани в базата данни на Leiden Open Variation за близо 200 пациенти (www.dmd.nl). Тъй като понастоящем няма лечение за „дисферлинопатии“, липсата на дисферлин води до прогресивна загуба на тъкан и функция на мускулите на крайниците и пояса. 5

европейско

Протеинът на дисферлин се експресира в много тъкани, но предимно в сърцето и скелетните мускули. В последния случай протеинът се намира на нивото на плазмената мембрана и в цитоплазмените везикули. 6 Счита се, че дисферлинът играе роля в трафика на везикули и възстановяването на мембранни пластири в мускулните клетки. 5 Загубата на дисферлин компрометира възстановяването на скелетната мускулна мембрана и води до прогресивна загуба на мускулни влакна. 6 Протеинът има различни домейни (Фигура 1). Базата данни ENSEMBL прогнозира шест или седем зависими от калций С2 липидно свързващи домейни, един трансмембранен домен и множество домейни "желязо" и "дисфункция". С2 домейните вероятно медиират калциево-зависимо сливане на везикули с плазмената мембрана, докато трансмембранните домейни закрепват протеина към плазмената мембрана. 5 Домените на желязо и дисфункция все още имат неизвестна функция. 4

Dysferlin домейни срещу DYSF екзони. Дисферлин съдържа шест или седем зависими от калций C2 липидно свързващи домейни (C2), трансмембранен домен (T), ферлен домен (L), FerA и FerB домейни (съответно A и B) и Dysf_N и Dysf_C домени (N и С, съответно). С2 и трансмембранните домени имат функция за възстановяване на мембраната. Функцията на останалите домейни все още е неизвестна.

Изображение в пълен размер

По този начин е възможно заобикалянето на мутациите на дисферлин да доведе до повече (частично) функционални протеини на дисферлин и следователно да има терапевтичен потенциал. Един от начините да се постигне това е да се модулира сплайсингът на дисферлиновите пре-РНК, като се използват антисенс олигонуклеотиди (AON) или антисенс последователности, които маскират целевите екзони на машината за сплайсинг, така че те да не бъдат включени в крайната иРНК („пропускане на екзон“ ) (Фигура 2). Първоначалното доказателство за концепцията наскоро беше показано в контролни и получени от пациента клетки, където прескачането на екзон 32 беше индуцирано от AONs или от модифициран U7 snRNP, в който оригиналната антисенс последователност беше заменена от целевата антисенс последователност. 9

Пропуснете екзон, предизвикан от антисенс. Ляв панел: в този пример мутация в екзон 32 води до преждевременно спиране на кодон (посочено от промяната от черно към бяло в пре-иРНК (отгоре) и иРНК (в средата), което води до преждевременно пресечен протеин (отдолу) Десен панел: Когато се използват антисенс олигонуклеотиди (AON), насочени към екзон 32, те се хибридизират с този екзон, като по този начин го маскират от механизма за сплайсинг, което кара този екзон да пропусне. Като екзон 32 в рамката (дължината му се дели на три), прескачането няма да наруши рамката за четене (иРНК ще почернее в средния панел) и може да се генерира пълен протеин, липсващ малко в средата (отдолу).

Изображение в пълен размер

Всъщност подходът за прескачане на екзон в момента е най-обещаващият терапевтичен подход за мускулна дистрофия на Дюшен (DMD). Това заболяване се причинява от пълна загуба на функционален дистрофин поради мутации, които нарушават отворената рамка за четене на гена DMD. Подобно на дисферлин, дистрофинът съдържа както основни, така и по-малко важни домени, подчертано от факта, че пациентите с мутации под централния излишен домейн имат по-малко тежко състояние, наречено мускулна дистрофия на Бекер. 12, 13, 14 Медицински екзон, прескачащ AON при пациенти с DMD, има за цел да възстанови отворената рамка за четене, да позволи производството на частично функционален протеин и превръщането на тежката DMD в по-лек фенотип на BMD. Този подход е разработен в нашата лаборатория и от колеги в Япония, Австралия и Великобритания 10, 15, 16, 17, 18 и в момента е в фаза I/II клинични изпитвания. 19, 20

В това проучване ще анализираме кои DYSF екзони могат да бъдат подходящи цели за антисенс-медиирано пропускане на екзон и кои са по-малко или неподходящи, в зависимост от кодиращите домейни на протеини и съобщените мутации. Ние също така показваме, че използването на нашите препоръки, установени след ретроспективен анализ на нашия набор от AON DMD, дава възможност лесно да се идентифицират AON, предизвикващи прескачане на екзон на DYSF .

Методите

База данни

Анализирани са мутациите, докладвани на 8 май 2009 г. в базата данни DYSF LOVD (www.dmd.nl).

Дизайнът на AON се основава на нашите препоръки за DMD екзони и има за цел да се насочи към частично отворени вторични РНК структури (предсказва се от m-пъти 21), наличието на предсказуеми RESCUE-ESE и SC35 и отсъствието на прогнозирани Tra2 β сайтове (използвайки човешко снаждане). търсач 22) и благоприятна свързваща енергия. 21, 23 Всички AON (Таблица 1) са насочени към вътрешни екзонови последователности и се състоят от 2′-O-метилова РНК с фосфоротиоатен скелет с пълна дължина и са произведени от Eurogentec (Seraing, Белгия).