Терапевтично доставяне на гени и трансфекция в човешки ракови клетки на панкреаса, използвайки епидермален растеж
Обобщение
Инженерната нановекторна система на основата на желатин тип B (SREG) е разработена за системно доставяне и трансфекция на гени при лечението на рак на панкреаса. Чрез модифициране на специфичния за епидермалния растежен фактор рецептор (EGFR) пептид на повърхността на наночастиците, те могат да насочат EGFR рецептора и да освободят плазмид при намаляване на околната среда, като високи концентрации на вътреклетъчен глутатион.
Резюме
Над 32 000 пациенти са диагностицирани с рак на панкреаса в Съединените щати годишно и заболяването е свързано с много висока смъртност 1. Има спешна нужда от разработване на нови клинично преводими терапевтични стратегии, които могат да подобрят мрачните статистически данни за преживяемост на пациента рак на панкреаса. Въпреки че генната терапия при рак показа огромни обещания, основното предизвикателство се крие в разработването на безопасна и ефективна система за доставка, което може да доведе до трайна експресия на трансгени.
Повечето антитуморни генни терапии се фокусират върху администрирането на туморни супресорни гени, като див тип p53 (WT-p53), за да се възстанови проапоптотичната функция в клетките 9. Механизмът p53 работи като основна сигнална среда в клетъчния растеж, която регулира апоптозата, спирането на клетъчния цикъл, метаболизма и други процеси 10. При рак на панкреаса повечето клетки имат мутации в протеина p53, причинявайки загуба на апоптотична активност. С въвеждането на тегла p53, апоптозата може да бъде възстановена и да предизвика клетъчна смърт в други ракови клетки.
Въз основа на горната аргументация, ние проектирахме модифицирани с EGFR пептид тиолирани желатинови наночастици за доставка на ген p53 и ефективност на теглото на оцененото доставяне и трансфекция на Panc-1 клетки.
Протокол
1. Приготвяне на EGFR капсулирани плазмидни ДНК насочени желатинови наночастици
2. Характеризиране на целеви EGFR наночастици
3. При in vitro проучвания за трансфекция с панкреатични ракови клетки на панкреаса
4. Представителни резултати
1. Синтез и характеризиране на целеви EGFR наночастици
Модифицирани с EGFR пептидни наночастици бяха синтезирани по схемата, показана на Фигура 1. Наночастиците, приготвени чрез десолватиране, бяха характеризирани по размер на частиците и зета потенциал. Средният размер на заряда и площта на частиците, приготвени от тиолирани желатини с различна степен на тиолация, са изброени в Таблица 1. Средният диаметър на частиците на различните наночастици е между 150-250 nm. Тиолираните наночастици имат по-малък размер в сравнение с желатиновите наночастици, вероятно поради дисулфидно свързване вътре в частиците. С различни повърхностни модификации размерите на наночастиците са се увеличили. Зета потенциалите на различните формулировки са около -20 mV. С SEM анализ се наблюдават размерът, морфологията на повърхността и сферичната форма на наночастиците и съответстват на комплекта Zetasizer. Ефективността на натоварване на ДНК в желатиновите наночастици и желатиновите тиолови наночастици е по-голяма от 95% (Таблица 1).
Характеристика на наночастиците
| Формулиране | Диаметър на наночастиците (nm) | Зета потенциал (mV) | Ефективност на зареждане с плазмидна ДНК (%) |
| NP гел | 151,4 ± 23,5 | -17,1 ± 5,23 | 95,6 ± 2,2 |
| SH-гел NP | 132,6 ± 17,9 | -24,6 ± 5,16 | 97,0 ± 3,8 |
| SH-гел-ПЕГ | 179,0 ± 30,9 | -22,3 ± 9,50 | 95,8 ± 6,5 |
| SH-гел PEG пептид | 230,8 ± 41,5 | -18,1 ± 4,02 | 94,8 ± 5,1 |
Вашиятbles 1. размер на частиците, повърхностен заряд и плазмидна ДНК инкапсулация контролират ефективността и насочени EGFR желатин и желатин тиол наночастици.
Използвани са сканирания с електронна спектроскопия с висока разделителна способност за химичен анализ (ESCA) за анализ на повърхностните компоненти на тиолиран желатин (SH-Gel NP), PEG-модифициран тиолиран желатин (SH-Gel PEG) и EGFR-пептид Тиол-модифицирани желатинови наночастици (SH-Gel PEG пептид). Резултатите в таблица 2 показват пиковите интензитети на СН (въглеводороди), CO (етер) и C = O (карбонил) групи при съответно 285.0, 286.3, 288.1 и eV. Етерният CO сигнал се увеличава след модификация и PEG намалява след пептидно конюгиране. Докато азотният състав намалява след модификацията и PEG се увеличава след модификацията на пептидите, което потвърждава присъствието на EGFR насочен пептид върху наночастиците. ESCA анализът допълнително потвърждава модификацията на PEG и пептидната повърхност.
Електронна спектроскопия за химичен анализ на повърхността на наночастиците от състава
| Формулиране | C 1s (%) | O 1s (%) | N 1s (%) |
| SH-гел NP | 59,3 ± 0,8 | 22,9 ± 0,5 | 12,9 ± 0,1 |
| SH-гел-ПЕГ | 58,2 ± 0,6 | 28,0 ± 1,2 | 9,5 ± 0,7 |
| SH-гел PEG пептид | 56,7 ± 0,8 | 25,9 ± 0,7 | 12,3 ± 0,6 |
| Формулиране | CC (%) | CO, N (%) | C = O (%) |
| SH-гел NP | 51.5 | 26.6 | 21.9 |
| SH-гел-ПЕГ | 17.1 | 63.1 | 19.8 |
| SH-гел PEG пептид | 33.1 | 42.8 | 24.1 |
Таблица 2. C 1S сканиране на електронна спектроскопия с висока разделителна способност за химически анализ (ESCA)