Създаване на коремни сраствания при мишки протокол (преведено на немски)
Въведение
Коремните сраствания са форма на белези, които се образуват в корема в отговор на възпаление, обикновено след операция или интраабдоминална инфекция. Адхезиите са основна причина за хронична коремна болка и безплодие и са водещата причина за обструкция на тънките черва 1. Наличието на сраствания прави втората коремна операция по-трудна за изпълнение и увеличава вероятността от усложнения 2.
Въпреки дългогодишните изследвания, механизмите, залегнали в основата на образуването на сраствания, остават слабо разбрани. Известно е, че първоначалното увреждане на перитонеалната повърхност причинява отделяне на богата на фибрин течност, която след това образува съсирек, който свързва повърхностите на червата и коремната стена 3 заедно. По-късно фибробластите и други клетки мигрират в адхезивната повърхност и отделят съединителна тъкан 4. С месеци до години се развива адхезията на кръвоносните съдове и нервите 5.
Съществуват няколко търговски продукта, предназначени да намалят образуването на сраствания след коремна операция (напр. Seprafilm). Всички тези продукти действат като механични бариери и спират образуването на адхезия, като предотвратяват физическия контакт между чревните бримки и коремната стена 6,7. Въпреки доказателствата от контролирано проучване, че хирургичната адхезионна бариера намалява образуването на сраствания 8, анекдотично много хирурзи са разочаровани от ефективността на механичните бариерни продукти.
Понастоящем не съществуват анти-адхезионни терапии, базирани на лекарства, което отразява факта, че точните процеси, свързани с образуването на адхезия, са слабо разбрани. Разработването на терапия, която конкретно е насочена към клетъчни или молекулярни агенти, участващи в образуването на сраствания, ще изисква по-добро разбиране на събитията, които участват в образуването на адхезия. Няколко групи са идентифицирали молекулярни механизми, които могат да бъдат важни за образуването на сраствания 9-11. Животинските модели осигуряват отлична среда за образуване на сраствания за изследване. Много изследвания са публикувани при няколко животни, особено плъхове и мишки 6,12-14, описващи хирургичното създаване на отговорност. Поради нашия опит с фиброза при мишки и широката наличност на трансгенни мишки и антитела на базата на мишки с проучването, ние избрахме мишката като наш модел за изследване на срастванията. Тук докладваме за технологията, която сме разработили за възпроизводимо и надеждно създаване на сраствания в мишката.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
Следният протокол е одобрен от институционалния комитет по грижа и употреба на живот на Станфордския университет (IACUC) и отговаря на всички институционални етични насоки относно използването на лабораторни животни.
1. Създаване на сраствания
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
До седем дни след операцията цекумът и евентуално възходящото дебело черво, черен дроб и бримки на тънките черва трябва да бъдат прилепнали към дясната коремна стена. (Фигура 8) Отстранените тъкани могат да бъдат вградени и изрязани и да дадат отлични хистологични разрези. (11, 12)
Ако процедурата е направена правилно, 100% от мишките трябва да имат значителни сраствания за седем дни. Смъртността трябва да бъде по-малка от 5%.
1 ">
trong> Фигура 9: Изрязване на адхезионната тъкан. а) и б) "Остров" от кожа и коремна стена, слети с подлежащото черво, се освобождава чрез изрязване в пълен кръг около прилепналата област. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.
jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Дискусия
Критичните стъпки в тази процедура са: старателно шлифоване на апендикса, без да причинява перфорация, поставяне на конци в коремната стена и прилагане на точното количество сила. Нанасяйте шкурка само върху цекума или върху малка специфична част от червата. Широкото използване на шмиргел върху големи количества тънки черва има тенденция да причини значителен илеус. Внимавайте да шлайфате сляпото черво с достатъчно сила, за да направите повърхността грапава, но не толкова, че стената да се напука. Намирането на този баланс може да отнеме време. Хванете внимателно червата и избягвайте остри или зъбни форцепси, за да манипулирате червата. Лесно е случайно да се предизвика кървене чрез хващане на мезентерията на тънките черва с форцепс или чрез прекалено силно издърпване на червата.
Ако се получи разкъсване на стената на апендикса, процедурата трябва да се спре и животното да се евтаназира. Според нашия опит, разкъсването на цекула води до смърт на животните след няколко дни, дори ако сълзата е възстановена добре. В допълнение, разкъсването на стената на апендикса ще доведе до разливане на изпражненията, което ще повлияе на възпалителния отговор по непредсказуеми начини.
Хемостазата трябва да е пълна в края на процедурата. Някои кървящи съдове ще се отворят отново и ще започнат след спиране на кървенето. Когато се съмнявате, поставете абсорбираща се монофилна фигура от шев на фигура осем около мястото на кървене Този тип конец е за предпочитане пред копринен или плетен абсорбиращ шев, тъй като може да се изтегли с минимално съпротивление, въпреки че тъканта. Установихме обаче, че коприненият или плетен абсорбиращ шев е най-ефективен за предизвикване на сраствания в коремната стена, отколкото монофиламентът, по-малко възпалителен.
Прилагането на нишесте в края на процедурата ще помогне да се увеличи образуването на сраствания, но установихме, че прекомерното количество нишесте ще предизвика възпалителен отговор, който причинява смърт. Нишестето трябва да се поръси леко. Не трябва да е толкова много, че да образува плътен слой.
Като първата процедура за научаване е обичайно да се губят множество мишки. Според нашия опит най-честите причини за смърт са дехидратацията поради илеус, причинена от прекомерна абразия на червата и сепсис поради чревна перфорация. Смърт, причинена от кървене, може да настъпи, ако не се постигне пълна хемостаза в края на операцията.
Ако образуването на сраствания е недостатъчно, помислете за агресивно износване на апендикса и дясната странична стена, което ще остави по-голяма здравина, или поставете повече конци върху коремната странична стена. Според нашия опит чакането по-малко от седмица преди корема води до по-малко от адекватно образуване на адхезия, за да се отвори отново. От друга страна, ако смъртността на мишките е висока след операция, помислете за използването на по-малко агресивна абразия на апендикса, по-точно за проверка на хемостазата, и прилагане на по-малко нишесте от друга страна. Също така е важно внимателно да наблюдавате дишането на мишката по време на операцията. Ако хирургът натрупа опит с тази процедура, смъртността трябва да бъде по-малка от 10%.
Тази техника е разработена, за да образува основно сраствания между апендикса и дясната коремна стена. Също така често се образуват сраствания между тънките черва, черния дроб и среза на средната линия. Използването на тази техника обикновено няма да причини сраствания от лявата страна на корема. Ограничение на тази техника е, че срастванията между червата и коремната стена са по-склонни да се образуват, отколкото срастванията между примки на червата. В допълнение, няма вероятност да се получи тъкан, пълна с лепило в напълно замръзнал стомах, което често се наблюдава при хора, които са имали множество операции.
Съдържание "> Тъй като тази техника постоянно кара адхезивната тъкан да се образува между апендикса и страничната стена, ние вярваме, че тя е идеално проектирана при тестови интервенции за намаляване на образуването на адхезия. Тази техника може да се използва и за изследване на молекулярните пътища и типовете клетки участват в образуването на адхезия. Адхезионната тъкан лесно се изрязва и е готова за хистология, осигурявайки отлични хистологични изображения (Фигури 11, 12) може да бъде.
Някои изследователи може да искат модел, при който срастванията да формират по-малко от 100% от времето. Пропускането на нанасянето на нишесте ще намали степента на адхезия до около 80%. Намаляването на броя копринени нишки, поставени в дясната коремна стена, допълнително ще намали скоростта на адхезия.
Според нашия опит, седмия ден след операцията е първият момент във времето, когато червата е постоянно прикрепена към коремната стена. Въпреки това, други моменти също могат да бъдат по-подходящи, в зависимост от фокуса на проекта. Например изследователите, които се интересуват от миграцията на неутрофили и макрофаги в стаята за задържане, може да пожелаят да могат да събират тъкан през първите пет дни след операцията. От друга страна, отлагането на колаген от фибробласти се извършва в продължение на седмици след първоначалното увреждане и за това е по-логично да се изследват тъканите, които се разпространяват в моменти, разпространени в продължение на няколко седмици след операцията.
Хирургичните лупи са много полезни за разширяване на хирургичното поле, докато извършвате тази процедура. Може да се използва и хирургичен микроскоп, но възможността на хирурга да инспектира хирургичното поле от различни ъгли е ограничена. Процедурата може да се извърши и без увеличение изобщо.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Разкриване
Авторите заявяват, че нямат финансови интереси.
Благодарности
CDM беше подкрепен от резидентската научна стипендия на Американския колеж на хирурзите (ACS). MSH беше подкрепен от Калифорнийския институт за регенеративна медицина (CIRM) Клиничен стипендиант за образование TG2-01159. MSH, HPL и MTL бяха подкрепени от Американското общество на челюстно-лицевите хирурзи (ASMS)/Фондация за челюстно-лицеви хирурзи (MSF) Изследователски грант. HPL беше подкрепена от гранта на NIH R01 GM087609 и подарък от Ингрид Лай и Бил Шу в чест на Антъни Шу. HPL и MTL бяха подкрепени от лабораторията за детска регенеративна медицина Hagey и фондацията Oak. MTL беше подкрепен от Фонда на Гън/Оливие.