С-генотипизиращ хепатитен вирус - Synevo

Обща информация и препоръки

Вирусът на хепатит С (HCV) е патоген с глобално разпространение и водеща причина за заболеваемост и смъртност. Според последните оценки, серопревариалността на HCV се е увеличила през последните 15 години до 2,8%, което се равнява на> 185 милиона инфекции в световен мащаб. Постоянната HCV инфекция се свързва с развитието на чернодробна цироза, хепатоцелуларен карцином и чернодробна недостатъчност с висока смъртност.

Подобно на други РНК вируси, HCV има значително генетично разнообразие на нуклеотидно ниво, което е основно предизвикателство както за развитието на HCV ваксини, така и за пангенотипични терапии.

Въз основа на филогенетичния анализ на геномната последователност, HCV щамовете понастоящем са класифицирани в 7 различни генотипа (HCV 1-7), които се различават един от друг в нуклеотидни последователности с 30-35% и в над 50 подтипа, сред които регистрира разлика от 15-25%. В допълнение, при заразените индивиди HCV циркулира и се държи като смес от различни вирусни популации, наречени квазивидове 1; 2 .

Геномът на HCV се състои от домейни, които се различават значително по скоростта на мутациите и вариабилността на нуклеотидните последователности. По този начин, непреведеният регион в 5 'края на генома (5'UTR) е най-добре запазеният домейн, с най-бавна еволюционна скорост. След това следва гена C (сърцевина), който кодира ядрото на протеина нуклеокапсид и който се развива три пъти по-бързо в сравнение с 5'UTR региона. Гените, кодиращи черупкови протеини Е1 и Е2, съставляват хипервариабилната област, която се различава от един изолат до друг. Това позволява на вируса да заобиколи имунните механизми на гостоприемника, насочени срещу достъпни протеини във вирусната обвивка. .

Според последните данни за общото разпространение на HCV, генотип 1 е най-разпространен (46,2% от всички случаи на HCV инфекция), последван от генотип 3 (30,1%); генотипове 2, 4 и 6 са отговорни за 22,8% от случаите, а генотип 5 за 1 .

У нас преобладават генотип 1b и смес от генотипове 1a и 1b 4. Проучване, проведено в института Matei Balş в Букурещ върху 670 пациенти, показва 99,7% разпространение на HCV генотип 1 5 .

Целта на антивирусната терапия е да излекува HCV инфекцията. Трайният вирусологичен отговор (SVR) се определя от неоткриваема HCV РНК 12 и 24 седмици след края на лечението. HCV инфекцията се излекува в над 99% от случаите, в които е получена SVR. При пациенти без цироза SVR обикновено се свързва с разрешаване на чернодробно заболяване, докато при тези с цироза, въпреки че чернодробната фиброза може да регресира и рискът от развитие на чернодробна недостатъчност и портална хипертония е намален, рискът от хепатоцелуларен карцином не е напълно елиминиран.

До 2011 г. лечението се основава на комбинацията от пегилиран интерферон α с рибавирин, като степента на отговор е различна в зависимост от генотипа на HCV. С този терапевтичен подход е получен процент на RVS от приблизително 40% в Северна Америка и 50% в Западна Европа за HCV генотип 1. По-високи нива на RVS (до 80%) са получени за генотипове 2, 3, 5 и 6, докато за генотип 4 са получени междинни нива на RVS 6 .

В началото на 2015 г. Европейската комисия разреши пускането на ново лекарство - Viekirax + Exviera, и лечението е одобрено за приложение със или без рибавирин при пациенти с хронична HCV инфекция с генотип 1, включително тези с компенсирана чернодробна цироза, HIV-1 коинфектирани пациенти, пациенти, подложени на лечение с опиатна зависимост, и пациенти, получаващи чернодробна трансплантация. . В допълнение, лекарството е одобрено в комбинация с рибавирин за пациенти с хроничен хепатит С генотип 4. Viekirax се състои от фиксирана доза комбинация от паритапревир 150 mg (протеазен инхибитор NS3/4A) и ритонавир 100 mg (CYP3A4 инхибитор, който увеличава паритапревир) в комбинация с омбитасвир 25 mg (инхибитор на NS5A) веднъж дневно, а Exviera се състои от дасабувир 250 mg (ненуклеозиден РНК-зависим инхибитор на РНК полимераза), прилаган два пъти дневно с или без рибавирин . Тази комбинация от антивирусни средства без интерферон синергично насочва репликацията на HCV на 3 различни нива. Според резултатите от 6 проучвания фаза III и 2 проучвания фаза II общата SVR на 12 седмици за пациенти, заразени с генотип 1, е над 96% 6; 7 .

В заключение се препоръчва генотипирането на HCV да се извършва при всички инфекции с вируси C, преди да се започне каквото и да е лечение, за да се избере подходящият протокол. .

Тестът, извършен в нашата лаборатория, използва техниката RT-PCR (обратна транскрипция на целевата РНК с генериране на комплементарна ДНК, която ще бъде усилена чрез PCR реакция, с откриване на ампликон в реално време) и флуоресцентно маркирани олигонуклеотидни сонди, специфични за всеки генотип, за идентифициране на генотипове HCV 1 до 6 и подтипове а и b от генотип 1 8 .

Събран образец - венозна кръв 8 .

Контейнер за прибиране на реколтата - вакуутан, съдържащ EDTA като антикоагулант 8 .

Необходима е обработка след прибиране на реколтата - отделете плазмата чрез центрофугиране 8 .

Обем на пробата - минимум 1 ml плазма 8 .

Стабилност на пробата - плазмените проби са стабилни за 1 месец при -20 ° C 8 .

Метод - PCR в реално време на автоматична платформа m2000 (Abbott); тестът използва като амплификационни цели последователност от 5'UTR областта на вирусния геном за откриване на генотипове 1-6 и NS5B региона за отделна идентификация на подтипове 1а и 1b; Използват се 4 комплекта праймери, изискващи 3 вида отделни реакции:

реакция А: открива всички HCV изолати, изолати от подтип 1а и изолати от генотип 3;
реакция В: открива изолати с генотип 2, подтип 1b и генотип 1;
реакция С: открива изолати с генотипове 4, 5 и 6.

При подготовката на всяка проба от пациент се въвежда РНК последователност, несвързана с генома на HCV, която ще служи като вътрешен контрол за всички етапи на процеса. Контролните проби (положителни и отрицателни) също се използват при всеки цикъл на пробите.

Точността на теста беше демонстрирана чрез анализ на 162 HCV изолати с генотип 1 (110 с генотип 1а и 58 с генотип 1b), 41 изолирани HCV генотип 2, 27 изолирани HCV генотип 3, 28 изолирани HCV генотип 4, 14 изолирани HCV генотип 5 и 12 изолирани HCV генотип 6. Техниката на секвениране на нуклеинова киселина се използва за определяне на референтния генотип във всяка анализирана проба. Съответствието между двата метода (PCR генотипиране и секвениране) е 97,59% за всички идентифицирани генотипове, 97,27% за подтип 1а и 91,38% за подтип 1b 8 .

Граници и смущения

HCV генотипирането не се препоръчва за скрининг или потвърждаване на HCV инфекция. Тестът е възможен само ако има C> 500 IU/mL виремия.

Олигонуклеотидната сонда, съответстваща на 5’UTR региона на HCV генома на генотип 1, не реагира кръстосано с проби, съдържащи HCV подтип 6а, но може да покаже кръстосана реактивност с подтип 6b и някои подтипове non6a/6b на генотип 6.

В някои случаи могат да се получат неразбираеми резултати поради хетерогенността на HCV геномните последователности, смесените инфекции или (рядкото) съществуване на рекомбинантни HCV щамове 8 .