Ролята на фосфолипидите и окислените липиди при обработката на амилоидния предшественик

От областта на експерименталната неврология, теоретична медицина и биологични науки на Медицинския факултет на Университета в Саарланд Хомбург/Саар Значението на фосфолипидите и окислените липиди за обработката на амилоидния предшественик протеин (APP) и болестта на Алцхаймер Дисертация за придобиване на степен доктор Естествени науки на Медицинския факултет на УНИВЕРСИТЕТА НА СААРЛАНД 2016, представена от Виола Й. Хаупентал, родена на 24 август 1982 г. в Саарбрюкен

обработката

(3.2.9) Определяне на активността на α-секретазата и ADAM-10 след ин витро инкубация 25 (3.2.10) Определяне на съдържанието на Aβ, sappβ и sappα. 26 (3.2.11) Определяне на съдържанието ADAM-17, BACE-1 и PS-1. 27 (3.3.) Липиден анализ. 28 (3.3.1) Екстракция на липиди от човешки мозъци след смъртта. 28 (3.3.2) Измерване на стабилността на DHA. 28 (3.3.3) Определяне на липидното съдържание чрез масспектрометрия. 28 (3.3.4) Определяне на съдържанието на фосфолипиди чрез тънкослойна хроматография. 29 (3.3.5) Определяне на съдържанието на HNE. 30 (3.3.6) Определяне на липидната пероксидация. 30 (3.4) РНК анализ. 31 (3.4.1) Изолиране на РНК. 31 (3.4.1) cdns синтез и полимеразна верижна реакция в реално време (RT-PCR). 31 (3.5) Статистическа оценка. 32 (4) публикации. 33 (4.1) Резюме на публикация 1 и описание на съвместното плащане. 33 (4.2) Резюме на публикация 2 и описание на съвместното плащане. 69 (4.3) Резюме на публикация 3 и описание на съвместното плащане. 87 (5) Разширено резюме. 102 (5.1) Липиди в AD. 102 (5.2) В контекст: Фосфолипиди, DHA и окислени липиди при преработката на APP и тяхната роля в AD. 104 (6) Резюме и Outlook. 117 (7) Участие в други публикации. 119 (8) Библиография. 121 (В) Благодарности. 133

Съкращения (B) Съкращения C градуса по Целзий µm микромоларен AA арахидонова киселина Aβ амилоид β AD болест на Алцхаймер ADAM α-секретаза A дезинтегрин и металопротеаза AICD вътреклетъчен APP домейн Aph engl. Предна фаринкса дефектна APO E аполипопротеин Е АРР амилоиден прекурсорен протеин ВАСЕ β-секретаза BSA говежди серумен албумин СОХ циклооксигеназа CTF С-терминалния домен на АРР DHA докозахексаенова киселина DMEM Dublecco модифицирана Eagle среда ДНК дезоксирибонуклеинова киселина ECE ендотелин-конвертиращия ензим ЕГЕ ендотелин-конвертиращия enzymesTA Етилен гликол тетраоцетна киселина EOAD Ранна форма на болестта на Алцхаймер EPA Ейкозапентаенова киселина FAD Семейна форма на болестта на Алцхаймер FCS Фетален телешки серум g/g грам/ускорение поради гравитацията GSK3β Гликоген синтаза киназа 3 часа HBSS Солеви буферен разтвор за първични неврони 3 H-H-G-GCR 3-метилглутарил коензим А редуктаза 5

Съкращения HNE 4-Hydroxynonenal HPLC високоефективна течна хроматография IDE Инсулин разграждащ ензим IP имунопреципитация LDH лактат дехидрогеназа измерване LDL липопротеин с ниска плътност LOAD Късна форма на болестта на Алцхаймер LOX липоксигеназа LRP1 липопротеинов рецептор 1 минута NP Melan NP-метанол P-40 метанол NP-метанол P-40 метанол NP-метанол P-40 метанол NP-метанол P-40 метанол NP-метанол P-40 метанол NP-метанол P-40 метанол NP-метанол P-40 метанол NP-метанол P-40 метанол NP-40 mg 1 Neuroprotectin-D1 NTF неврофибриларни заплитания OD оптична плътност P p-стойност, ниво на значимост PBS фосфатно-буфериран солев разтвор PC фосфатидилхолин PE фосфатидилетаноламин PL плазмолог PS фосфатидилсерин PSEN англ. Подобрител на пресенилин RIP Регулирана интрамембранна протеолиза RNS рибонуклеинова киселина RT стайна температура RT-PCR в реално време полимеразна верижна реакция SAD Спорадична форма на болестта на Алцхаймер sapp разтворим APP s втори SDS натриев додецил сулфат PAGE полиакриламиден гел електрофореза SPT серин палмитоил-коензим WBA тип WBA синтетичен коазим Wenza Wenza Wenza Wenza Wenza Wenza

Въведение След като а-секретазата е отрязана, свързаната с мембраната αctf се разцепва от у-секретазата, която освобождава малкия фрагмент p3 в цитозолната AICD и извънклетъчно. За разлика от амилоидогенния път, AICD от неамилоидогенния път се разгражда в клетката от ензима, разграждащ ензима (IDE), поради което транскрипционната значимост на този AICD е противоречива (Belyaev et al. 2010). Функцията на p3 все още е неясна. Преглед на обработката на APP е показан на фигура 1. Фигура 1 Схематично представяне на обработката на APP, модифицирано от (Grimm, Rothhaar & Hartmann 2012). Неамилоидогенната обработка, показана по-горе вдясно, се поема от α- (зелена) и γ-секретаза (синя). Първоначално се образуват разтворимият sappα и мембранният αctf. Тогава се образуват p3 и AICD. Ар е маркиран в червено в APP. Амилоидогенната обработка е показана долу вляво. Β-секретазата реже APP, което води до sappβ и βctf. Тогава Aβ и AICD се освобождават от γ-секретазата. 16.

Публикации на липидите в клетките и изолираните мембрани, което беше извършено от S. Grösgen (фигура S5), извърших инкубациите на липидите. За определяне на съдържанието на PC, PE и PS чрез тънкослойна хроматография, което беше извършено от B. Hundsdörfer (фигура S2), и определянето на липидния профил, извършено от S. Grösgen (таблица S5), имам мембраните от SH -SY5Y клетки и изолирани човешки мозъци след смъртта. Проведох статистическия анализ на данните, използвайки ANOVA в сътрудничество с V. Zimmer и J. Lehmann (фигура 1-4, таблица S1-4). Публикация 1 може да бъде намерена по-долу. Оригиналът на публикацията може да бъде намерен на уебсайта на издателя MDPI AG (Базел, Швейцария), www.mdpi.com/journal/ijms, под номер doi: 10.3390/ijms14035879. 35

Допълнение Rothhaar et al Publica ons Фиг. S1 Цитотоксичност след липидна инкубация Фиг. S2 Контрол на специфичността при анализ на -секретаза Фиг. S3 Контрол на специфичност при анализ на -секретаза цитотоксичност 5 4 3 2 1 [%] n.s. н.с. флуоресценция (-секретазна активност) [RFU] контрол + -секретазен инхибитор флуоресценция (-секретазна активност) [RFU] контрол + -секретазен инхибитор PC 22: 6 PC-PL 22: 6 PE 22: 6 PE-PL 22: 6 0 2000 4000 6000 8000 време [сек] 0 1000 2000 3000 4000 5000 време [сек] Фиг. S4 Контрол на специфичността при флуоресценция на -секретазен анализ (-секретазна активност) [RFU] контрол + -инхибитор на секретаза 0 2000 4000 6000 време [сек] 86

Публикации В допълнение към анализа в живи клетки, извърших инкубацията на мембрани от клетки SH-SY5Y и последващото измерване на активността на β-секретазата и оцених данните статистически (Фигура 2в). Определянето на експресията на секретазите беше извършено от J. Mett след моята инкубация на клетките с окислени липиди (фигура 2г). T. Blümel определя активността на β- и γ-секретазата след инкубация с DHA (резултати в текста) и C. Stahlmann DHA стабилност (резултати в текста); Проведох инкубацията с липиди и за двата анализа. Статистическата оценка на нивата на Ар след инкубация с DHA и окислени липиди е извършена от Н. Mylonas (резултати в текста). Публикация 3 може да бъде намерена по-долу. Оригиналът на публикацията може да бъде намерен на уебсайта на издателя S. Karger AG (Базел, Швейцария), www.karger.com/ndd, под номер doi: 10.1159/000440839. 89