Регулиране на автоимунни заболявания чрез PTPN CT полиморфизъм и NCF1 гена
От Института за клинични изследвания на мозъка на Херти към Университета в Тюбинген Отдел по обща неврология Изпълняващ длъжността медицински директор: професор д-р А. Регулиране на автоимунни заболявания чрез Melms от полиморфизма PTPN22 1858 * C/T и встъпителната дисертация на NCF1 ген/псевдогенна структура за получаване на докторска степен по медицина на медицинския факултет на университета Eberhard Karls в Тюбинген, представена от Peter Hoffmann от Щутгарт Бад Канщат 2010 г.
Декан: професор д-р I. B. Autenrieth 1-ви докладчик: професор д-р Д-р R. Weissert 2-ри докладчик: професор д-р Т. Гасер
Съдържание 1 Списък на съкращенията 1 2 Въведение и въпрос 3 2.1 Сложни генетични автоимунни заболявания 3 2.1.1 Определение и епидемиология 3 2.1.2 Етиология и патогенеза 3 2.2 Миастения гравис и протеин тирозин фосфатаза нерецептор 22 6 2.2.1 Миастения гравис 6 2.2.1.1 Определение 6 2.2.1.2 Епидемиология 6 2.2.1.3 Симптоми 6 2.2.1.4 Курс 7 2.2.1.5 Неонатална миастения 8 2.2.1.6 Съпътстващи заболявания 8 2.2.1.7 Невромускулно предаване 8 2.2.1.8 Патогенеза 10 2.2.1.9 Значение на тимуса 11 2.2.1.10 клинични класификации и резултати 12 2.2.1.10.1 Класификация според Ossermann и Genkins 12 2.2.1.10.2 Резултат от Myasthenia Gravis според Besinger 13 2.2.1.11 Диагностика 13 2.2.1.11.1 Фармакологично изпитване 13 2.2.1.11.2 Повтаряща се стимулация с помощта на електромиография 13 2.2.1.11.3 Диагностика на антитела 14 2.2.1.12 Терапия 15 2.2.1.12.1 Инхибитори на ацетилхолинестеразата 15 2.2.1.12.2 Имуносупресивна терапия 16 2.2.1.12.3 Тимектомия 16 2.2.2 Протеин тирозин фосфатаза не-рецептор 22 17 2.2.3 Изследователски въпрос 18 2.3 Множествена склероза/малария и неутрофилен цитозолен фактор 1 19 I.
2.3.1 Мултиплена склероза 19 2.3.1.1 Определение 19 2.3.1.2 Епидемиология 19 2.3.1.3 Картина на заболяването 20 2.3.1.4 Форми на курса 20 2.3.1.5 Диагностични критерии 21 2.3.1.6 Прогноза 24 2.3.1.7 Патогенеза 25 2.3.1.8 Диагностика 27 2.3.1.8. 1 Диагностика на CSF 27 2.3.1.8.2 Електрофизиологична диагностика 28 2.3.1.8.3 Магнитно-резонансна томография 28 2.3.1.8.4 Скали за оценка на увреждане 28 2.3.1.9 Терапия 28 2.3.2 Малария 31 2.3.2.1 Определение 31 2.3.2.2 Епидемиология 31 2.3 .2.3 Цикъл на развитие на паразита 31 2.3.2.4 Симптоми 32 2.3.2.5 Терапия 33 2.3.3 Реактивни метаболити на кислород 33 2.3.4 Неутрофилен цитозолен фактор 1 35 2.3.4.1 Определение 35 2.3.4.2 NADPH оксидаза 35 2.3.4.3 CF1 ген и псевдогени 36 2.3.4.4 NCF1 и автоимунни заболявания 40 2.3.5 Изследователски въпрос 40 3 Материал и методи 41 3.1 Миастения гравис и PTPN22 41 3.1.1 Пациенти 41 3.1.2 Материал и оборудване 41 3.1.2.1 SNP генотипиране 41 II
3.1.2.2 Анти-титиново антитяло Elisa 41 3.1.2.3 Радиоимуноанализ на анти-AChR антитела 42 3.1.3 Методи 42 3.1.3.1 SNP генотипиране 42 3.1.3.1.1 SNP генотипиране Смес 42 3.1.3.1.2 Taqman Universal Master Mix 43 3.1.3.1.3 Полимеразна верижна реакция, принцип 43 3.1.3.1.4 Генотипизиране, принцип 43 3.1.3.1.5 Полимеразна верижна реакция, изпълнение 45 3.1.3.2 Антититиново антитяло ELISA 46 3.1.3.2.1 Ензимно-свързан имуносорбентен тест, принцип 46 3.1.3.2.2 Антититиново антитяло ELISA 46 3.1.3.3 Радиоимуноанализ на анти-AChR антитела 48 3.1.3.4 Статистически анализ 48 3.2 NCF1 и множествена склероза/малария 49 3.2.1 Популация от пациенти 49 3.2.2 Материал и оборудване 50 3.2.2.1 Разделяне на ДНК от пълноценна човешка кръв 50 3.2.2.2 Генотипиране на NCF1 50 3.2.2.3 Електрофореза в агарозен гел 51 3.2.2.4 Разделяне на клетки на моноцити и гранулоцити 51 3.2.2.5 Преброяване и разреждане на полиморфно-ядрени клетки и мононуклеарни клетки на периферна кръв 52 3.2. 2.6 Маркиране на антитяло с R-фикоеритрин 52 3.2.2.7 Брадфордски тест 53 3.2.2.8 Оцветяване на моноцити и гранулоцити с R-PE-белязани р47-фокс (D-10) антитела 53 3.2.3 Методи 53 3.2.3.1 ДНК отделяне от пълноценна човешка кръв 53 3.2. 3.2 NCF1 генотипиране 54 3.2.3.2.1 Taqman Universal Master Mix 54 3.2.3.2.2 Полимеразна верижна реакция 55 III
3.2.3.2.3 Генотипиране 55 3.2.3.3 Електрофореза в агарозен гел 56 3.2.3.4 Клетъчно разделяне на моноцити и гранулоцити 56 3.2.3.4.1 Клетъчно разделяне 56 3.2.3.4.2 Разделяне на моноцити и лимфоцити 57 3.2.3.4.3 Разделяне на Гранулоцити 57 3.2.3.5 Преброяване и разреждане на PMN и РВМС 58 3.2.3.6 Етикетиране на антитяло с R-фикоеритрин 58 3.2.3.6.1 p47-фокс (D-10): sc-17845 58 3.2.3.6.2 Маркиране 58 3.2 .3.7 Тест на Брадфорд 59 3.2.3.7.1 Принцип 59 3.2.3.7.2 Процедура 60 3.2.3.8 Оцветяване на моноцити и гранулоцити с белязани с R-PE антитела р47-фокс (D-10) 60 3.2.3.9 Поточна цитометрия/Флуоресцентно активирано сортиране на клетки 61 3.2.3.9.1 Принцип 61 3.2.3.9.2 Поточна цитометрия 61 3.2.3.10 Статистически анализ 62 3.2.3.10.1 Малария 62 3.2.3.10.2 Множествена склероза 62 4 Резултати 63 4.1 Миастения гравис и PTPN22 63 4.1.1 Резултати от измерванията 63 4.1.2 Честота на алелите и разпределение на генотипа 63 4.1.3 Честота на алелите в подгрупи на пациенти с МС 64 4.2 NCF1 и множество Коефициентите на склероза/малария 66 4.2.1 GT/GTGT и коефициентите на MS 66 4.2.2 GT/GTGT са свързани с подфенотипите на коефициентите MS 66 4.2.3 GT/GTGT и малария 69 4.2.4 Корелация на GT/GTGT Съотношение с производството на ROS при пациенти с малария 70 IV
4.2.5 GT/GTGT коефициенти и концентрация на хемоглобина 70 4.2.6 Поточна цитометрия на моноцити, лимфоцити и гранулоцити 71 5 Дискусия 73 5.1 Миастения гравис и PTPN22 73 5.1.1 Въведение 73 5.1.2 Асоциация на полиморфизма PTPN22 с миастения гравис 73 5.1.3 Асоциация на полиморфизма PTPN22 с появата на анти-AChR антитела и анти-титинови антитела 73 5.1.4 Анти-титинови антитела и тимоми 74 5.1.5 Генотипове в зависимост от състоянието на тимома 75 5.1.6 Анализ на подгрупи на пациенти с MG без тимом 75 5.1.7 Сравнение на нашите резултати с предишни проучвания 76 5.1.8 Обобщение и перспективи 78 5.2 NCF1 и множествена склероза/малария 79 5.2.1 Въведение 79 5.2.2 GT/GTGT коефициенти при пациенти с множествена склероза 79 5.2.3 GT/Коефициенти на GTGT при пациенти с малария и сравнение с производството на ROS 80 5.2.4 Критика на метода 81 5.2.4.1 Генотипизиране на фрагменти от NCF1 81 5.2.4.2 Поточна цитометрия на моноцити, лимфоцити и гранулоцити 82 5.2 .5 Резюме и перспективи 82 6 Резюме 83 6.1 Миастения Гравис и PTPN22 83 6.2 NCF1 и множествена склероза 84 6.3 NCF1 и малария 85 7 Библиография 86 Благодарности 104 Автобиография 105 V
Списък на съкращенията 1 Списък на съкращенията ACh = Ацетилхолин ACHR = ацетилхолинови рецепторни AIE = автоимунни заболявания BSA = говежди серумен албумин CTLA4 = цитотоксичен Т-лимфоцитен антиген 4 DNS = дезоксирибонуклеиновата киселина ЕАЕ = Експериментален автоимунен Encephalomy = Förster = Експериментален автоимунен Encephalomy = Förster Статус = разширен Encephalomy = Förster Status Scale = разширен Encephalomy = Förster = разширен Encephalomy = напред човешки левкоцитен антиген IVIg = интравенозни имуноглобулини KI = доверителен интервал LYP = лимфоидна тирозин фосфатаза MG = миастения гравис MGB = малък канал за свързване MHC = основен комплекс за хистосъвместимост MRT = ядрено-магнитен резонанс MS = множествена склероза NADPH = никотинамид 1-фосфат NOSPHHA 1 ниспинамид фосфат Нечетно съотношение p47-фокс = протеин47 фагоцитна оксидаза PBMC = мононуклеарни клетки от периферна кръв PBS = буфериран с фосфат физиологичен разтвор PCR = полимеразна верижна реакция Phox = фагоцитен вол idase PMA = phorbol-12-myristate-13-acetate PMN = полиморфни ядрени клетки 1
Списък на съкращенията PTPN22 = протеин тирозин фосфатаза нерецептор 22 RA = ревматоиден артрит ROS = реактивни кислородни метаболити (реактивни кислородни видове) R-PE = R-фикоеритрин SSC = страничен разсейване SLE = системен лупус еритематозус SNP = единичен нуклеотиден полиморфизъм 2
Въведение и изследователски въпрос 2.2.1.8 Патогенеза При MG плътността на AChR йонния канал се намалява на мускулната крайна плоча [Pestronk et al., 1985] и крайната плоча се разрушава. Синаптичната пролука между нервния край и постсинаптичната мускулна мембрана се увеличава [Engel et al., 1976]. AChR йонните канали, свързани от автоантитела, се ендоцитират и разграждат по-бързо. Медиирано от комплемента, свързването на антитела води до разрушаване на постсинаптичния апарат с намаляване на постсинаптичния пръстов апарат (вж. Фиг. 2). AChR антителата директно блокират AChR йонния канал [Köhler et al., 2003]. Намаленият брой отворени AChR йонни канали води до по-нисък потенциал в мускулната крайна плоча, който вече не е достатъчен за генериране на потенциал за действие. По-малък брой активирани мускулни влакна води до мускулната слабост, описана по-горе. Дори при пациенти с чисто очни симптоми се наблюдава намаляване на AchR в крайните пластини на крайниците, което обаче остава субклинично. A: здрава нервно-мускулна трансмисия B: нервно-мускулна трансмисия при миастения гравис Фиг. 2: нервно-мускулна трансмисия [от Drachman, D. B., 1994] 10
Въведение и изследователски въпрос 2.2.1.9 Значение на тимуса При пациенти с MG тимусът често е морфологично променен. Има тимит с лимфофоликуларна хиперплазия, атрофия на тимуса или тимома. Една от причините за тази асоциация може да бъде антигенна молекулярна мимикрия: собствени или екзогенни антигени, които са подобни на епитопите на AChR йонните канали, активират автореактивни Т клетки. Като екзогенни антигени могат да се използват компоненти на вируси на херпес симплекс или бактериални инфекции, при които се обсъжда индукция на MG [Schwimmbeck et al., 1989]. При злокачествения тимом има повишена експресия на неврофиламенти, които могат да функционират като автоантигенни детерминанти, тъй като имат AChR-подобен епитоп. Тимомите се откриват в 8,5-15% от случаите при пациенти с MG [Wilkins et al. 1999, Loehrer 1999, Otto 1998]. 11.
Въведение и изследователски въпрос 2.2.1.10 Клинични класификации и резултати 2.2.1.10.1 Класификация според Ossermann и Genkins Класификацията според Osserman и Genkins (вж. Таблица 1) е установена за оценка на тежестта на състоянието на MG. Таблица 1: Класификация на миастения гравис според Ossermann и Genkins (1971) Клас Клинична форма Симптоми I Очна форма Птоза, диплопия IIa Лека генерализирана форма Лека генерализирана слабост IIb Фациофарингеална форма IIa + булбарна слабост III Тежка остра генерализирана форма Остра тежка генерализирана слабост, bulbar симптоми, дихателна недостатъчност IV тежка хронична генерализирана форма тежка, често прогресираща генерализирана слабост 12
Въвеждането и въпросът за MG, характеризиращи се най-вече с орофарингеална слабост и по-малко очни симптоми [Evoli et al., 2003]. 2.2.1.12 Терапия Лечението на MG се основава на следните стълбове [Köhler et al., 2003]: - Прилагане на ACh естеразни инхибитори, които подобряват нервно-мускулното предаване - Имуносупресивна или имуномодулираща терапия за намаляване на антигенните антитела -Комплекс, предизвикана възпалителна реакция - Интервенционални терапевтични мерки за лечение на остро влошаване като миастенична криза, напр. терапевтичен плазмен обмен посредством плазмафереза или имуноадсорбция [Shibuya et al., 1994] - тимектомия 2.2.1.12.1 Инхибитори на ацетилхолинестеразата ACh естеразни инхибитори се свързват в близост до каталитичната единица на ACh естераза и там са значително по-бавни в сравнение с ACh хидролизиран. Карбамиловата група се прехвърля ковалентно към ACh естеразата и инхибира ензимната активност в продължение на часове. Захранването с ACh в синаптичната междина се увеличава и ACh има повече време да заеме местата на свързване на постсинаптичната мембрана. Най-честата активна съставка е пиридостигмин бромид (Mestinon) в дози до 300 mg/ден. 15-ти
Инициирането и въпросът се диагностицират, ако има временно и пространствено разпространение на лезиите, напр. се открива чрез изображения (вж. таблица 2). За да се диагностицира МС, трябва да се изключат подобни клинични картини (напр. Колагеноза, васкулит, борелиоза или саркоид). МС е когато критериите са изпълнени и няма по-добро обяснение за клиничните симптоми. Възможна МС е, когато се подозира, но критериите не са напълно изпълнени. 22-ри
Въведение и изследователски въпрос FAD = флавин аденин динуклеотид Fe = желязо GDI = инхибитор на дисоциацията на гуанозин дифосфат GDP = гуанозин дифосфат GTP = гуанозин трифосфат NADPH = никотинамид аденин динуклеотид фосфат NADPH оксида фосфол px47 единици px47 фосфол px4747xx px47 px47 pxx47 p свързаните с мембраната единици gp91-phox и p22-phox. За активиране е необходимо взаимодействие между p47-фокс и свързаните с мембраната единици. На първо място, Rac протеинът трябва да се отдели от Rho GDI протеина и да влезе в състояние, активирано чрез GTP. Тогава това може да се свърже с плазмената мембрана. Плазменият комплекс изисква няколко фосфорилирания, така че да се свърже с мембранно свързани елементи. Активираната NADPH оксидаза произвежда супероксидни аниони, които се освобождават във фагоцитни везикули или в извънклетъчното пространство [Heyworth et al., 2003]. Фиг. 3: Активиране на NADPH оксидаза [от Heyworth et al. 2003] 37
Въведение и въпрос В човешкия геном има два псевдогена (ψncf1) на NCF1 ген. Те са 98% идентични с гена NCF1 и са разположени в същия регион 7q11.23 на хромозома 7 [Heyworth, Cross et al., 2003]. Прави се разлика между тип I ogenenncf1, който съдържа изтриването на GT в началото на екзон 2, и тип II ψncf1, който не съдържа изтриване на GT [Heyworth, Noack et al., 2002]. В популацията обикновено има два различни хаплотипа, по-често срещаният хаплотип с две копия от тип I ψncf1 и едно копие на NCF1 и по-рядко срещаният хаплотип с едно копие от тип I и тип II ψncf1 и едно копие на функционалния ген [Heyworth et ал., 2002]. Честото появяване на GT мутация при хронична грануломатоза може да бъде обяснено хипотетично чрез събития на рекомбинация между NCF1 и тип I ψncf1 (виж фиг. 4). Поради близостта им и високата степен на сходство такива събития на рекомбинация могат да се появят по-често. Тип II ψncf1 вероятно възниква от рекомбинация между NCF1 и тип I ψncf1. Фиг. 4, модел на възможно кросоувър между NCF1 и Тип I Typencf1 [от Heyworth et al., 2003] 38