Пътят на зарядната врата на свързания с епилепсия калиев канал приема химични лиганди

субекти
абстрактно
Въведение
Резултати
Основни роли на консервирания фенилаланин (F137) в активността на ztz240
Идентифициране на по-критични остатъци в KCNQ2-VSD
Структурен модел на ztz240 свързване към KCNQ2-VSD
Откриване на нови активатори за джоба за подвързване ztz240
Антиепилепсийна активност на активаторите, насочени към пътя на зареждане на портата
дискусия
Още информация
PDF файлове
Допълнителна информация, Фигура S1
Допълнителна информация, Фигура S2
Допълнителна информация, Фигура S3
Допълнителна информация, Фигура S4
Допълнителна информация, Фигура S5
Допълнителна информация, Фигура S6
Допълнителна информация, таблица S1
Допълнителна информация, таблица S2
Видеоклипове
Допълнителна информация, филм S1

Видео: Jeep Wrangler Hitch Mounted Cargo Rack XL (1987-2016 YJ, TJ & JK) Преглед и инсталиране (ноември 2020).

субекти

абстрактно

Въведение

Резултати

Основни роли на консервирания фенилаланин (F137) в активността на ztz240

Идентифициране на по-критични остатъци в KCNQ2-VSD

F137 е в средата на S2 сегмента на KCNQ2 VSD. Проектирахме повече мутанти за остатъците, които покриват VSD. Сред функционалните мутации E130A, I134A, G138A, R207W и R210A драстично намаляват потенциращата активност на ztz240 и в трите основни аспекта. Те намаляват нарастването на съотношението на амплитудата на тока навън (I/I 0) и предотвратяват или отслабват лявото изместване на кривата на GV (ΔV 1/2) и забавянето на деактивирането (Фигура 2). Почти припокриващите се опашни токове на тези мутанти със и без ztz240 ясно показват намалените ефекти върху деактивирането (допълнителна информация, Таблица S1). За разлика от това, мутациите S105A и M174A намаляват лявата смяна на GV кривата, но не намаляват съотношението I/I 0 или предотвратяват забавянето на деактивирането (Фигура 2 и допълнителна информация, Таблица S1). Идентифицирането на няколко основни остатъка допълнително показва значението на VSD за активността на ztz240.

Идентифициране на по-критични остатъци в KCNQ2-VSD за активността на ztz240. (А) Представителни следи от идентифицирани критични мутанти със и без 10 μM ztz240. (Б) Ефекти от 10 μM ztz240 върху амплитудата на външния ток на VSD мутанти (n> 3). Всяко място на мутация е посочено въз основа на предсказаните трансмембранни области. Прекъснатата линия показва ниво на потенциране от 10 μM ztz240 на дивия тип KCNQ2 канал. Потенциалът за изпитване е +50 mV. (° С) Ефекти от 10 μM ztz240 върху V 1/2 на VSD мутантите (n> 3). Δ V 1/2 показва промяната в V 1/2 след прилагането на ztz240. ΔV1/2 = V1/2 в присъствието на ztz240 - V1/2 в контрола.

Структурен модел на ztz240 свързване към KCNQ2-VSD

Тъй като експерименталните структури на KCNQ2 и неговите комплекси с други лиганди не са определени, е трудно да се изгради структурен модел за взаимодействие ztz240-KCNQ2. Съответно е използвана йерархична стратегия за конструиране на структурния модел чрез широко използване на хомологично моделиране, молекулярно скачване и симулация на MD във връзка с мутагенеза и електрофизиологични определяния. Резултатът от мутагенезата предполага, че потенциалният свързващ джоб на ztz240 се намира във VSD, а не в други домейни (Фигура 1). По-нататъшни електрофизиологични експерименти показват, че ztz240 се свързва с VSD в отворено състояние (допълнителна информация, фигура S3). Затова първо създадохме триизмерен (3D) модел за трансмембранния домейн на KCNQ2 въз основа на структурната информация на отворения Kv1.2 канал 29, 30, 31 с Discovery Studio 2.6 (допълнителна информация, фигура S1B).

Моделът на облигации ztz240 с VSD. (A, Б) Общ (А) и подробно (Б) Изгледи на взаимодействията между ztz240 и VSD. ztz240 и остатъците са показани като топки и пръчки. Въглеродните, кислородните, азотните, хлорните, флуорните и водородните атоми в ztz240 са съответно оцветени в светло синьо, червено, тъмно синьо, зелено, оранжево и бяло. За яснота са показани само няколко ключови водородни атома. Водородните връзки или електростатичните взаимодействия са обозначени с червени линии. Взаимодействието CH-π и халогенната връзка са обозначени съответно с черни и зелени линии. (° С) Структурата на свързващия джоб, извлечена от структурните модели на лиганд-VSD комплекси. Лигандите са премахнати за по-голяма яснота. Повърхността на чантата е показана в жълто. От дясната страна са показани три напречни сечения на чантата отвън. Остатъците са показани като пръчки. „Out“ и „In“ обозначават външната и вътрешната страна на клетъчната мембрана.

Повечето критични остатъци, облицоващи джоба за свързване, са в S2 и S4, като E130, I134, F137, G138, R207 и R210, докато много малко остатъци в S1 и S3 влияят на връзката, като S105 и M174 (Фигура 3)), които не са запазени в KCNQ изоформи. За по-нататъшна оценка на ролята на остатъците във външните сегменти на S1 и S3 при активирането на ztz240, останалите остатъци, с изключение на изброените в 2B и 2C, бяха изследвани чрез сканиране на аланин и никой от тях не повлия значително в активността на ztz240 ( Допълнителна информация, таблица S1)). Тези допълнителни мутации и електрофизиологични определяния потвърждават ретроспективно нашия модел на свързване ztz240-KCNQ2 отново.

Моделът на взаимодействието ztz240-KCNQ2 ясно описва широк джоб във VSD, който се простира от извънклетъчната уста на VSD до R210 (Фигура 3C). Този възможен джоб за свързване на ztz240 в KCNQ2 частично се припокрива със съответните региони на пътищата за зареждане на портата на химерните канали Shaker и Kv1.2-2.1, въпреки че е по-обширен и по-дълбок (1A и 3C) 5, 6, 7, 8 9, 10, 11, 12, 14, 15. Тази констатация е в съответствие с предишни проучвания, които предполагат, че VSD на Kv каналите може да са места за наркотици 19, 20. Нашето проучване също така установи, че пътят на зареждане на портата на KCNQ2 може да има нова функционалност, която действа като директно свързващ джоб за съществуващи и новоразработени активатори като ztz240 и нови съединения, открити в това проучване (вижте по-долу).

Откриване на нови активатори за джоба за подвързване ztz240

Структурният виртуален скрининг идентифицира активатори с различни хемотипове. (А) Увеличението на амплитудата на външния ток в присъствието на съединението, както е посочено. Тестовият потенциал е -10 mV. Прекъснатата линия показва ниво на степенуване 1 (т.е. без степенуване). (Б) Криви доза-отговор на YG002, YG025 и YG027 (n> 3 за всяка точка от данни). (° С) Химични структури на откритите активатори. Фрагментите, които са ориентирани към вътреклетъчния край на VSD, са подчертани в оранжево. (Д) Общ изглед на насложени модели на свързване на девет идентифицирани активатора с VSD.

Антиепилепсийна активност на активаторите, насочени към пътя на зареждане на портата

Извършен е първичен скринингов тест срещу епилепсия, за да се оцени активността на тези съединения при мишки, използвайки модела на пристъпа, предизвикан от Maximum Electroshock (MES). Сред тестваните активатори ztz240, YG007 и YG018 показаха степен на защита> 50% и следователно бяха избрани за по-нататъшно разследване в индуцирани от MES и индуцирани от пентилентетразол (PTZ) модели на припадъци (допълнителна информация, таблица S2). Ретигабин е прекратен като положителна контрола. И трите съединения показаха отлична антиепилепсийна активност и в двата модела. В MES-индуцирания модел на припадъци, еднократно приложение на трите съединения значително предотвратява удължаването на задните крака на тоника. Степента на защита (100%, 90% и 90%) е сравнима с тази на ретигабин (Таблица 1). В PTZ-индуцирания припадъчен модел трите съединения показват антиепилепсийна активност, сравнима с тази на ретигабин. Единична доза от тези съединения не само значително забавя латентността на клонингите, но също така намалява честотата на генерализирани тонично-клонични припадъци (GTCS) и смъртността (Таблица 2).

дискусия

Пътят на заряда на затвора на канала KCNQ2 приема химични лиганди. (А) Подробности за това как активаторите взаимодействат и влияят на R207 и R210, когато са отворени, като използвате примера на ztz240 и YG002. Активаторите запълват пространството между R207 и R210. Прекъснатите линии показват взаимодействието между активаторите и R210. (Б) Чертежът показва как химичен лиганд действа върху пътя на заряда на вратата, като е в пътя на заряда на вратата и предотвратява преминаването на аргинина в своето низходящо състояние.