Първична трансплантация на зародишни клетки за базирано на CRISPRCas9 скачане в протокол Xenopus

Обобщение

Гените от съществено значение за оцеляването създават технически бариери пред създаването на мутантни линии. Leapfrog заобикаля леталността, като комбинира редактиране на генома с първична трансплантация на зародишни клетки, за да създаде диви животни, носещи мутации на зародишна линия. Изгарянето на стъпките също така позволява ефективното генериране на хомозиготни нулеви мутанти в поколението 1F.Тук е демонстрирана стъпката на трансплантация.

Резюме

Въведение

Очаква се Бонд да ускори генетичните подходи в Ксенопус. Burn Steps също предоставя алтернатива на метода "трансфер на гостоприемник" 22 за LOF анализ на гените на майчиния ефект (непубликуван). В тази публикация подробно описание на метода, фокусирано върху трансплантацията на PGCs, е представено в X. tropicalis (с малки модификации за X. laevis). Тук е демонстрирана PGC трансплантация, за да се улесни по-бързият трансфер на тази технология в други лаборатории, които работят с Xenopus. Принципите на този метод трябва да бъдат успешни при други земноводни (напр. Уродели), а специфичните за организма модификации в методологията трябва да позволяват прилагане към много други животни, чиято ефективна мутагенеза може да бъде постигната и PGC е лесно трансплантируема.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички методи, описани тук, са одобрени от Комитета по планиране на Калифорнийския университет, Ървайн и Институционални грижи за животните.

1. Препарати, предназначени за PGC трансплантация

250 ug sgRNA; Виж го Дискусия) 24. След 10 до 20 минути изцеление на мястото на инжектиране, прехвърлете ембрионите в покрита с агароза чиния, съдържаща 1/9 x MMR и инкубирайте при 25 ° C. Също така създайте ястие от недвойни ембриони, което ще служи като реципиенти на трансплантация. Пригответе чаши на Петри (60 mm), които съдържат a

5 mm дебел слой от 1% агароза в 0,3 x MMR, ако се правят трансплантации на органи в X. tropicalis, или 1 x MMR за X. laevis.

3-4 mm дълбоко чрез вмъкване на калъп с 3- x 4 ямки (създаден чрез изрязване на 96-гнездна PCR плака) в разтопената агароза, докато изливате плочите (вижте фигура 1 и д). Задръжте формата няколко милиметра над дъното на чашата на Петри с чифт клещи, прикрепени към държача на пръстена, докато агарозата се втвърди.

Също така направете 24-кладенчева едноплодна ембрионална плоча, като покриете ямките с тънък слой от 1% агароза в 1/9 x MMR.
Забележка: Културната среда, добавена към тези ямки, е 1/9 x MMR, допълнена с 50 ug gentamycin sulfate/mL.

2. Трансплантация на PGC

3. след излекуване, грижи за ембриона

ЗАБЕЛЕЖКА: Присадките зарастват на място вътре

30 минути и е нормално да се наблюдават някои остатъци от лизис на жълтъчни клетки, отделящи се от ембриона (Фигура 3).

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

След трансплантацията трябва да се направи качествено определяне на ефикасността на мутагенезата на CRISPR/Cas9, преди да се положат каквито и да е усилия в развъждането, за да се развият и поддържат животните до полова зрялост. Тъй като животните, които носят трансплантации на високосна жаба, са соматично див тип и зародишната линия е трудно достъпна за директни измервания, става важно да се спасят труповете на донорски ембриони. ДНК анализът на трупа действа като прокси за измерване на мутагенеза, която се среща при реципиенти на трансплантирани зародишни клетки 17 .

Подобни резултати са получени от 17 F0 кръстосващи се животни, носещи мутации в хомеотичната кутия (кодираща ДНК свързващия хомеодомен) на гена на goosecoid (CGC) (вж. Фигура 4 а, C-H). Липсата на експресия на CGC, използвайки антисенс морфолино олигонуклеотиди в X. laevis предполага, че генът CGC е необходим за цялостно развитие на предната глава 32, а капулите, инжектирани с Cas9-sgRNA, също виждат ембрионални летални фенотипи 17. Обаче 0 F скокообразните животни, които са соматично див тип, са жизнеспособни и здрави, а 1 F кръстосано произведени ембриони с LOF фенотипове, идентични с тези, публикувани в X. laevis fold pass 17. Тези данни осигуряват генетично потвърждение на морфолино фенотипа, както и принципно доказателство, че прескачането на етапите преодолява ембрионалните летални фенотипи.

Фигура 1: Материали, необходими за трансплантация. Боросиликатно стъкло (AT) Пастьорските пипети се използват за производство на ножове за коса и вежди за микрохирургия на ембриони в ранен стадий. Рисуването върху стъклото с помощта на горелка Bunsen позволява по-тесен край за поставяне на косата. Червената стрелка показва приблизителното положение, при което стъклото трябва да се счупи. (Б.) пример за нож за коса на веждите (отгоре) и примка за коса (отдолу), пипетирани надолу с бързосъхнещо лепило. (СРЕЩУ), част от 96-ямкова PCR плака се използва за създаване на вдлъбнатини в плака с агарозен гел, като позволява 1% агароза да се втвърди около формата (агароза, направена при 0,3 х 1 х MMR, според това, че трансплантациите на органи се извършват в X. tropicalis или X. laevis, съответно). Дебелината на агарозата е

5 мм, с кладенци с дълбочина 3-4 мм. (д) пример за трансплантирана агарозна гелна плака с 12 вдлъбнатини, както е показано в таблицата СРЕЩУ. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.