Протокол за образец на мишка с хронична салмонела (преведен на немски)

Обобщение

Установете модел на мишка за хронична бактериална инфекция с персистираща колонизация на Salmonella Typhimurium в червата в продължение на 27 седмици.

Резюме

Моделът на мишка с бактериална инфекция е мощен модел за изследване в области като инфекция, възпаление, имунология, сигнална трансдукция и туморогенеза. Много изследователи са се възползвали от колит, предизвикан от Salmonella Typhimurium, за изследване на ранните етапи на възпаление и инфекция. Въпреки това, малко съобщения за хронична инфекция са in vivo. Мишки със устойчиво съществуване на салмонела в стомашно-чревния тракт ни позволяват да изследваме дългосрочно взаимодействие гостоприемник-бактерия, трансдукция на сигнала и туморогенеза. Установихме модел на мишка с хронична бактериална инфекция с колонизация на Salmonella Typhimurium в червата на мишката в продължение на 6 месеца. За да се използва тази система, е необходимо изследователят да се научи как да подготвя бактериалната култура и да прави животни. Ние подробно описваме методология за приготвяне на бактериална култура и мишки за сонда. Ние също така показваме как салмонелата открива персистиране в стомашно-чревния тракт. Като цяло този протокол ще помогне на изследователите с модела на бактериална инфекция при мишки да отговорят основно на биологични и микробиологични въпроси.

Протокол

Този протокол има три части: бактериална култура, назогастрална сонда на мишка и откриване на салмонела.

1. Състояние на растеж на салмонела.

  1. Пригответе плочата на Salmonella Luria-Bertani Broth (LB), инкубирайте при 37 ° C през нощта.
  2. Изберете клонинг от LB плаката и поставете в 7 ml LB в туба от 12 ml и разклатете при 37 ° C за около 5 часа.
  3. Инокулирайте 50 ml LB с 0,05 ml неподвижна фаза на културата и при 37 ° C без разклащане за около 18 часа.
  4. Завъртете една нощ бактериална култура при стайна температура при 6000 об/мин за 10 минути, за да суспендирате бактериите в HBSS със съотношение 100: 3 (LB: HBSS). Например:
    Всяка 50 ml LB култура ще бъде суспендирана в 1,5 ml HBSS.
  5. За епруветката за хранене на животни допълнително разредете бактериалната култура в съотношение 1:10. Например:
    Всяка 1,5 ml LB култура ще бъде суспендирана в 15 ml HBSS.

2. Модел на инфекция със салмонела *.

  1. Пригответе стрептомицинов разтвор. Всяка мишка ще получи 7,5 mg стрептомицин в 100 µl HBSS. Например, пригответе общо 90 mg стрептомицин в 1,2 ml HBSS за 10 мишки. Винаги малко повече обем, когато приготвяте разтвора на стрептомицин.
  2. Изтеглете вода и храна 4 часа преди перорално лечение.
  3. Дайте мишки със стрептомицин със 7,5 mg стрептомицин (100 µl HBSS за контролни мишки). Хванете здраво кожата над рамото на мишката с палеца и средния пръст, изправете главата и врата с показалеца, за да изправите хранопровода. Подравнете върха на топката на иглата за хранене на покрива на устата и от дясната страна на гърлото, след това внимателно го прекарайте надолу в хранопровода и инжектирайте 100 μl разтвор. Не трябва да се усеща съпротива.
  4. На 20 часа след лечението със стрептомицин водата и храната се изтеглят отново, преди мишките да се заразят с бактерии.
  5. Дайте на всяка мишка, третирана със 100 µl суспензия в HBSS или със стерилен HBSS (контрола), през орален път. Процедурата на сонда е същата като на 2,3) мишки със сорт стрептомицин.

* Проведени са проучвания върху животни с използване на специфични без патогени женски мишки C57BL/6 (Taconic, Hudson, NY) на възраст 6-7 седмици, както е описано по-горе 1. Протоколът е одобрен от Университетския комитет по животински ресурси към Университета в Рочестър (UCAR).

3. Откриване на салмонела в червата.

  1. Събирайте изпражнения с мишката (приблизително 100 mg).
  2. Прехвърлете пробата на изпражненията в епруветка от 1,5 микро-центрофуги с 1 ml PBS и енергично завихрете.
  3. Центрофуга за 10 минути при 800 оборота в минута. Прехвърлете супернатантата в чиста микроцентрифужна епруветка.
  4. Центрофугиране при 6000 об/мин за 5 минути. Супернатантът се изхвърля и 200 μl PBS се добавя към гранулите и се завихря.
  5. Нанесете 200 μl PBS с еднократна шейкър за еднократна употреба върху плоча BBL CHROMagar, за да откриете салмонела. Салмонелата изглежда лилаво (розово до лилаво, виж фигура 1). Ако 200 μl дава твърде много колонии на плочата, използвайте 100 μl или 50 μl за лентата.

4. Представителни резултати.

Ако протоколът е направен правилно, колонизацията на Salmonella typhimurium може да бъде открита в червата на мишката за повече от 6 месеца. Салмонелата може да бъде открита чрез фекална култура в продължение на 6 месеца (фиг. 1). Както е типично за този модел, загубата на телесно тегло и смъртта настъпват в рамките на 4 седмици след инфекцията. В зависимост от щамовете салмонела, използвани за инфекция, някои мишки не могат да оцелеят повече от 6 месеца.

мишка
илюстрация 1. Чревната салмонела при видовете салмонела изглежда лилаво (розово до лилаво) на цвят, поради метаболитни разлики в присъствието на избрани хромогени. Други бактерии или се инхибират, или произвеждат синьо-зелени или безцветни колонии.

мишка
Фигура 2. Процент на оцеляване на мишки, заразени с мутант на Salmonella PhoP c, PhoP c Avra- и PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra ​​в продължение на 4 седмици (28 дни).

маса 1. Телесно тегло на мишки, заразени със салмонела в продължение на 4 седмици.

0 1 седмица Две седмици 3 седмици 4 седмици
контрол 16,78 ± 1,05 16,91 ± 1,28 18,26 ± 1,23 19,31 ± 1,26 20,26 ± 1,15
PhoP c 16,89 ± 1,03 17,14 ± 1,19 17,43 ± 1,63 * 18,68 ± 1,78 20.05 ± 1.11
PhoP c Avra- 16,91 ± 1,12 16,96 ± 1,39 17,06 ± 2,14 ** 18,71 ± 2,18 20,15 ± 1,56
PhoP c AvrA-/AvrA + 16,94 ± 0,96 17,17 ± 1,02 17,63 ± 1,42 * 18,44 ± 2,03 20.09 ± 1.17

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

За да използва тази система, е необходимо изследователят да се научи как да храни животните през назогастрална сонда. Ние подробно описваме методология за приготвяне на бактериална култура и изследване на мишките. Ние също така показваме как да наблюдаваме устойчивостта на салмонелата в стомашно-чревния тракт (стомашно-чревния тракт). Критичните стъпки в този протокол, включително:

  1. Предварително лечение със стрептомицин: Предварителното лечение със стрептомицин може да се отърве от някои коменсални чревни флори и да направи мишките податливи на инфекция със салмонела 2.
  2. Тръбичка за хранене със салмонела: За начинаещите епруветката за хранене може да бъде предизвикателство. В даден момент назогастралната сонда се проваля, тъй като разтворът случайно се инжектира в дихателните пътища и причинява смърт на мишката.
  3. Устойчива бактериална колонизация: нуждае се от внимателно наблюдение на бактерии в стомашно-чревния тракт. В допълнение към фекалната култура на мишката, съдържанието на приложението може да се използва и за откриване на салмонела в плочи от BBL CHROMagar. Съберете съдържанието на апендикса, когато жертвате мишки след инфекция със салмонела.

Тествахме колонизацията на салмонела при мишки при различни концентрации: 1 х 10 3 образуващи колонии единици до 1 х 10 8 образуващи колонии единици (100 μl/мишка). На 1 x 6-10 октомври x 10 8 образуващи колонии единици, Salmonella успяха да колонизират мишките. Следователно, въз основа на нашите предишни публикации 1, 5 и непубликувани данни, крайната концентрация на салмонела в този разтвор няма да бъде измерена преди хранене със стомашна сонда.

В тази експериментална процедура имаме специфични без патогени женски мишки C57BL/6 (Taconic, Hudson, NY), които са били на 6-7 седмици. Използваните бактериални щамове включват щам на Salmonella typhimurium див тип ATCC14028s (WT-SL), непатогенен мутант на Salmonella PhoP c3, PhoP c Avra ​​и PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra ​​(Таблица 2). Използвайки този протокол, колонизацията на Salmonella typhimurium в червата на мишката може да бъде открита за повече от 6 месеца (фиг. 1). Инфекция и възпаление на салмонела, измерени чрез наблюдение на изпражненията и теглото на момчетата. Когато се вземат тъканни проби и кръв, дължината на червата се измерва като характеристика на възпалението на червата. Теглото на далака и черния дроб също бяха изследвани. Миши серумни цитокини бяха тествани с ELISA5. Освен това, биохимични и молекулярни методи се използват по-нататък за тестване на промените в възпалителните цитокини и патологичните промени, индуцирани от салмонела 5.

Обикновено загубата на тегло и смърт настъпват в рамките на 4 седмици след инфекцията (Таблица 1). След инфекция със салмонела има значителна загуба на телесно тегло в групите с бактериални инфекции в сравнение с контролната група без бактериално лечение (* pc заразени, 78% PhoP c Avra- или 70% PhoP c AvrA-/AvrA + може да продължи с Салмонелите оцеляват в червата. След острата инфекция всички оцелели все още са носили салмонела, която може да бъде открита след инфекция 6 месеца след процедурата, описана в това предложение. След като мишките оцелеят 3 седмици след инфекцията, мишките са натрупали телесно тегло и е имало по-малко смъртни случаи В допълнение, данните от оцветяването с имунофлуоресценция също показват инвазията на Salmonella в чревната лигавица 27 седмици след инфекцията (фиг. 3). Тези данни показват, че PhoP c, PhoP c Avra ​​или PhoP c AvrA/AvrA + може да се използва за модела на хронична инфекция.

Мишките с фактор на резистентност към гостоприемника Nramp1 +/+ са устойчиви на инфекция със салмонела 3-6. C57/BL6 мишки с NRAMP са дефектни в настоящите проучвания. Установихме, че 90% мишки, заразени с патогенен щам Salmonella 14028s, не могат да оцелеят след 4 седмици (данните не са показани). За да се разберат дългосрочните ефекти на див тип S. Може да се използват инфекция с тифимуриум, мишки с Nampr1 +/+.

Този модел е създаден в лаборатория BSL-2. Нашият протокол е одобрен от Университетския комитет по животински ресурси към Университета в Рочестър (UCAR). Мишките, заразени със салмонела, вероятно ще изпитват дискомфорт и стрес и ще станат по-малко активни и бавни. Козината им може да бъде настръхнала и не им е позволено да се хранят или пият както обикновено. Животните ще бъдат наблюдавани отблизо и ако има някакви признаци на дискомфорт, като например не се амбулират достатъчно добре, за да запазят хидратацията и приема на калории, ако мишка е показала признаци, че има аспирирана течност или значителна загуба на тегло (10% или повече) 7 и не веднага умре, мишката беше хуманно евтаназирана. Целият лабораторен персонал ще бъде обучен да наблюдава мишките съгласно 8, 9.

Много проучвания за предварително лечение на стрептомицин са се възползвали от колит, предизвикан от Salmonella typhimurium, за проучвания на ранната фаза на инфекцията 1,2,10. Само няколко обаче съобщават за хроничната инфекция в миши модел in vivo 11. Мишките със устойчиво съществуване на салмонела в стомашно-чревния тракт ни позволяват да изследваме дългосрочно взаимодействие гостоприемник-бактерия, трансдукция на сигнала и туморогенеза. Установихме модел на мишка за хронична бактериална инфекция с колонизиране на Salmonella typhimurium в червата на мишката в продължение на 6 месеца. Този модел може да се използва и за изследване на патогенезата на E. coli и пробиотиците. Като цяло този протокол ще помогне на изследователите с фундаментално важния модел на мишката да отговори на биологични и микробиологични въпроси.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.