Протокол за анализ на енергийните разходи на Danio Rerio с висока производителност (преведен на немски)
Резюме
Въведение
В момента мишката е доминиращ модел за изследване на затлъстяването. Краткото интервал на генериране и генетичните инструменти, налични в мишката, са ненадминати до момента. Обаче зебрата също има кратък интервал на генериране (3-4 месеца) и дори превъзхожда мишката в проста генетична манипулация 1,2. Даниото поддържа почти 90% от гените на бозайници, докато мишката поддържа много над броя на потомството и потенциала за използване в генетични и лекарствени скрининг 3.
За да се отключи потенциалът на модела на данио за проучвания за затлъстяване, трябва да се разработят тестове за изследване на фактори, които влияят върху регулирането на теглото, включително енергийните разходи. Като метаболити, кислородът се преработва чрез β-окисление и цикълът на трикарбоксилната киселина се консумира и се получава NADH 2. По този начин NADH 2 е директен индикатор за потока на метаболитите през метаболитните пътища (метаболитно окисление). При пойкилотермите Н + изтича през вътрешната митохондриална мембрана, отделеното от синтеза на АТФ окисляване на NADH 2 е 4-5 пъти по-малко, отколкото при топлокръвните животни 4. Съответно, в рибите зебра NADH 2 е много здраво свързан с производството на АТФ чрез окислително фосфорилиране свързани. Тук описваме тест, който измерва производството на NADH 2 в ларви на риба зебра като прокси за потребление на енергия 5.
Консумацията на кислород е златният стандарт за измерване на енергийните разходи. Въпреки това, най-добре е да се използва високият потенциал за пропускане на анализа на зебра, тъй като консумацията на енергия трябва да бъде достъпна за висока производителност. Системите за потребление на кислород, които зависят от циркулационна система със затворена камера, са ограничени в производителността от броя на наличните камери 6. Тестове за потребление на O 2 на открито/CO 2 на открито също се прилагат в рибата зебра 5.7. Тези 96-кладенечни плочи на открито от BasisD Systems са достъпни за висока производителност. За съжаление, обменът на газ с околната среда ограничава чувствителността на тези анализи. Наскоро публикувахме приложението на анализ, който наблюдава NADH 2 с редокс индикатора alamarBlue 5. Този тест преодолява ограниченията в производителността и чувствителността в общите анализи на консумацията на кислород в рибата зебра.
Рибата данио е все по-важен модел за изследване на енергийната хомеостаза на цялото тяло. Отчасти защото зебрафите са достъпни в бъдеще с помощта на генетични екрани и скрининг на наркотици. В допълнение, целенасочена генетична манипулация, включително доплащане и нокаут, може да се приложи бързо. По-рано показахме, че този тест може да се комбинира с доставка на лекарства за баня и генетична добавка или нокаут, за да се идентифицират съединения и гени, които променят скоростта на метаболизма В допълнение, този тест трябва да се използва за предимствата с висока производителност, присъщи на рибите зебра.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
ЗАБЕЛЕЖКА: Този протокол следва насоките на Службата за отговорни изследвания на Университета в Аризона и е одобрен от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните
1. Размножаване и поддържане на ембриони от зебра
2. Пригответе тестов разтвор
- Пригответе тестовия разтвор съгласно таблица 1. Разтвор за анализ на стерилен филтър, използвайки 0,22 µm филтър. Преди да започнете теста, затоплете стерилния разтвор за изпитване във водна баня с температура 28,5 ○.
| съставна част | % От общия брой | Обем (ul/10 ml) |
| 60x Е3 ембрион среда | 1.667 | 166.7 |
| Двойно дейонизирано (DDI) H 2 0 | 96.233 | 9,623.3 |
| Аламарно синьо- | 1 | 100 |
| 400 mM NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0,1 | 10 |
Таблица 1 Тестова среда
4. Оценете относителната промяна във флуоресценцията, свързана с лечението
- Промяна във флуоресценцията от всяко изчисление също чрез изваждане на флуоресценцията във време 0 от флуоресценцията в края на изследването. Кладенците без риба (заготовки) трябва да имат стойности, близки до 0, много под стойностите на кладенци, които съдържат риба.
Промяна във флуоресценцията = флуоресценция в края - флуоресценция във време 0 - За да се определи относителната промяна във флуоресценцията, се изчислява средната промяна във флуоресценцията за контролните ямки, след което се разделя промяната във флуоресценцията всяка от средната промяна във флуоресценцията за контролните ямки. Трябва да се отбележи, че контролът може да бъде или контрол на превозното средство или генетичен контрол.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
Нефлуоресценция на разтвора за анализ при отсъствие на ембрионални риби (1) увеличавам. Тестът обаче е много чувствителен към малки промени в скоростта на метаболизма в сондажа. Една риба в кладенеца създава ясен сигнал от празни кладенци в рамките на 1 час (Необходим е абонамент за P. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Дискусия
Замърсяването с бактерии или гъби значително ще ограничи прилагането на този анализ. Метиленовото синьо в Е3 ембрионната среда ограничава възможността от замърсяване с гъбички. По време на отглеждането на ембриони е важно да се внимава за отстраняване на мъртвите ембриони два пъти на ден. Освен това е важно внимателно да се изследват ембрионите със стерилна E3 ембрионна среда в деня на зоната за започване на анализа. Тези 2 стъпки ограничават възможността за бактериално замърсяване на ембрионите. Включването на празните кладенци, описано в стъпка 3.2, позволява откриване на бактериално замърсяване. Рядко се среща бактериално замърсяване, което дава измерим сигнал. Ако обаче празните кладенци показват надежден сигнал, анализът трябва да се повтори, трябва да се внимава да се поддържа чистотата на ембрионите. Ако потребителят очаква, че има замърсяване преди осеменяването, ембрионите могат да бъдат избелени, както е описано по-горе (стр. 22) 10. Алтернативно, ако експериментаторът подозира, че замърсяването се случва след събирането, потребителят може да E2 назад с пеницилин и стрептомицин за използване на ембрионите до 4 dpf (стр. 23) 10.
Въпреки че този тест е ценен за използване при ембриони, ние не сме изследвали неговата валидност при възрастни зебра. Подозираме, че всички функции в този тест ще бъдат ограничени при възрастни риби поради лошо проникване в тъканите на AlamarBlue. В допълнение, при храненето на рибите чревната флора може да генерира дълбок сигнал, който няма значение за метаболизма на рибите. По този начин, този тест е да се възползва от използването в яйчен жълтък, хранещ ембрионални риби. Относителната неактивност на ембрионалните риби предлага уникално предимство, тъй като това ограничава променливостта, която би била свързана с предизвиканите от активността енергийни разходи 11. Така че този тест е уникален инструмент за изследване на скоростта на метаболизма в отговор на генетични или фармакологични манипулации в цяла животинска система.
Рибата зебра бързо се превръща във водещ модел за метаболитни нарушения, които съпътстват затлъстяването. Всъщност има модели на трансгенно и свързано с диетата затлъстяване на риба-зебра, публикувани 12,13 Подобно на моделите на мишки, индуцираното от диетата затлъстяване при зебрата увеличава серумните триглицериди и натрупването на липиди в черния дроб 12. Освен това фуражите на зебра имат повишена глюкоза на гладно, което предполага непоносимост към глюкоза 14. Използвайки описаното тук, ние показахме, че 24-часовото предварително лечение с метформин Инсулинов сенсибилизатор, повишава метаболизма в отговор на инсулиново лечение 5 тест. По този начин рибата данио може да се окаже идеален модел за цялото животно за откриване на лекарства, които подобряват инсулиновата чувствителност (ембрион) и да установят тяхната ефективност при облекчаване на затлъстяването от инсулинова резистентност (възрастни).
Разработването на генетични и индуцирани от диетата модели на затлъстели ребра данио, които имитират фенотипове, наблюдавани при затлъстели бозайници, създава тласък за иницииране на умиране на рибки зебра, фокусирани върху метаболитни заболявания. Налични са тестове с висока производителност, за да се оцени изцяло стойността на модела зебра за изследване на енергийната хомеостаза. Иновативни инструменти, които позволяват фагична оценка на задвижването за екрани, фокусирани върху енергийния прием, докато тестовете за съхранение на липиди с висока производителност ще доведат до изследвания на хомеостазата на липидите на цялото тяло 15-17. Анализът, който описваме тук, е инструмент с висока производителност за оценка на участието на гени, съединения или тяхното взаимодействие върху енергийните разходи на цялото тяло.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.