Представено от Майкъл Преукшас, роден в Бремен - PDF безплатно изтегляне
Дезоксихипузин синтаза като възможна цел за лечение на мултиформен глиобластом и ролята на еукариотния фактор за иницииране на транслация eif-5a2 in vivo за придобиване на званието доктор на природните науки в Департамента по биология, Факултет по математика, компютърни науки и естествени науки, Университет в Хамбург представено от Майкъл Преукшас, роден на 27 септември 1981 г. в Бремен Хамбург 2012
Коригирана версия Дата на оспорването: 30.08.2013 г. 1-ви рецензент: проф. Д-р Йоахим Хаубер 2-ри рецензент: проф. Д-р Джулия Кер ii
Голямата трагедия на науката - убиването на красива хипотеза с грозен факт. "Президентско обръщение на Томас Хенри Хъксли в Британската асоциация за 1870 г.," Биогенеза и абиогенеза "(Събрани есета, том 8) iii
Списък на съкращенията 6! По време на2 тази работа2 произведени2 публикации2и! Презентации с плакати2. 2100! 7! Литература2. 2102! 8-ми! Приложение2. 2115! 8.1! Последователности на грунда 2115! 8.2! Lentiral2 вектори2. 2116! 8.3! eifj5ajexpression2in2glioblastomen2 (Rembrandtjdatabase) 2. 2117! 8.4! Декларация2застраховане2. 2122! iv
Списък на съкращенията TMZ TPZ WHO Temozolomide тумор-размножаващи се клетки Световна здравна организация (Световна здравна организация) iii
Обобщени щандове. С помощта на тази нокаутираща мишка могат да бъдат получени нови знания за системните и специфични за органите функции при бозайниците. iii
Инициирането е частично изразено на ниво мрна, но почти неоткриваемо на ниво протеин 5,6,8. И двата протеина са кодирани от собствения си ген и всеки се транскрибира в пет транскрипта. Някои от транскриптите имат различни 3 -UTR или са съкратени, което оказва влияние върху скоростта на транслация и формирането на полизом на eif-5a2-mrna, особено в случая на транскриптите eif-5a2, и е възможно да участва в регулирането на израз 8. Eif-5a2-mrna също има по-ниска стабилност от тази на eif-5a. По този начин, поне част от различното изразяване на двете изоформи изглежда е обяснимо от тези пост-транскрипционни механизми. Ензимът DHS е отговорен за първата стъпка в синтеза на хипузин. Повечето еукариоти имат един единствен dhps ген, запазен в еукариотите и археите, който кодира DHS. Досега са открити три варианта на транскрипция при хора, от които обаче само един кодира активен протеин 9. Полиаминът спермидин служи като субстрат за DHS. Прехвърлянето на аминобутиловия остатък от спермидин към eif-5a-лизин 50 е NAD-зависим процес и по принцип обратим. DHS е a
Въведение за намаляване на свързаната с апоптоза смърт на панкреатичните островни клетки. Ролята на eif-5a във възпалителните реакции, които са от решаващо значение за развитието на диабет, е отразена и в други сценарии. Перорално приложима форма на CNI-1493, наречена CPSI-2364, е тествана за лечение на болестта на Crohn, автоимунно хронично възпалително заболяване на червата. И тук беше показан противовъзпалителен ефект, който беше свързан с инхибирането на DHS. Хипотезата, че протеините eif-5a и хипузин-образуващите ензими участват в патогенезата на много злокачествени новообразувания, се подкрепя от все по-голям брой изследвания. Следователно оценката на участието на тези протеини в други видове рак беше очевиден избор. Тук злокачествените новообразувания представляват особен интерес, за които до момента са налице само няколко ефективни терапевтични възможности. Те включват по-специално мозъчни тумори с по-висок клас, лечението на които рядко е успешно, независимо дали е хирургично, с класическа радио/химиотерапия или целенасочени молекулярни терапии. Следователно eif-5a1/2, DHS и DOHH са изследвани като възможни терапевтични цели при астроцитоми с по-висок клас. 9
Въвеждането на специфичните онкогени при всеки пациент ще бъде необходимо с оглед на хетерогенността между туморите. Тъй като има и голяма доза хетерогенност и u. Възможно е да има клонално развитие в GBM тумор 120 и биопсията често не може да открие всички мутации 121, нови, икономически ефективни технологии (напр. Екзоме секвениране) и насочването на различни, непотребни цели вероятно ще помогне за облекчаване на тези трудности да се преодолеят. 18-ти
Материал и методи 19 2 Материал и методи 2.1 Материал 2.1.1 Химикали и среди за бактерии Таблица 2: Химикали и реагенти, използвани в тази работа. Химически/Реагент/Средно Aceglow ECL-Разтвор Акриламид-Бис, 30% Адриамицин (Доксорубицин) Агароза Ампицилин BCNU Брадфордски Реагент BSA Бромофенол Син CHAPS Хлороформ Хлорохин Дифосфат DEPC-Вода DMEM + Глутамакс ДМСО ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетат Ацетил Ацетил киселина Телешки серум (FCS) Глутаралдехид (50%) Глицин Глицерин Хемал в съответствие с Mayer Изопропанол Производител на калиев ацетат Peqlab Roth Sigma-Aldrich Invitrogen Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Bio-Rad Roth Roth Roth Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Ingo Roth Roth Sigma-Aldrich Invitrogen Roth Roth Roth Roth Roth Roth 19
Материал и методи 20 Калиев хлорид LB агар LB среда Обезмаслено мляко на прах β-меркаптоетанол Метанол (MeOH) M-MuLV Натриев ацетат Натриев хлорид Натриев хидроксид Натриев ортованадат Неесенциални аминокиселини Oligo d (t) Праймер Параформалдехид PBS Пеницилин/Стрептомицин Риблоцикол ОРБблокин OUT Rotiszint eco plus солна киселина (HCl) SDS SOC-среден спермин спермидин SYBR Green PCR Master Mix TEMED Temozolomide Tritium spermidine Tris Base Tris-HCl TriFast Roth Roth Roth Roth Sigma-Aldrich JT Baker Fermentas Roth Roth J.T. Baker Sigma-Aldrich Gibco Invitrogen Sigma-Aldrich Lonza Gibco GE Healthcare Invitrogen Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Roth Invitrogen Fermentas Roth Roth Sigma-Aldrich Roth Invitrogen Roth Roth Finnzymes Roth Sigma-Aldrich Perkin-Elmer Sigma-Aq
Материали и методи 21 Trypan blue TritonX-100 0,5% трипсин + EDTA Tween20 Урея Biochrom Sigma-Aldrich Gibco Roth Sigma-Aldrich 21
Материали и методи 22 2.1.2 Оборудване и материали Неизброените материали и оборудване са стандартно лабораторно оборудване Таблица 3: Оборудване и материали, използвани в тази работа. Оборудване/материали Cryovial CultureSlides, 4 камери Поточен цитометър FACSCalibur камери за електрофореза FUSION SL Advance Gel документация Кабинет Eagle Eye II GenePulser XCell Хомогенизатор Omni TH Имобилон PVDF мембрана Mastercycler Gradient Microplate четец Wallac Victor микроскоп Клетъчна култура Axiovert 40 милилитра, ND 1000 захранване PowerPac NuPage полиакриламидни гелове ProteanXL Размер ExtraThick Blot Paper в реално време PCR-Cycler Mx3000P рентгенови филми рентгенова касета TransBlot SemiDry-Blotter Tri-Carb 2900TR Vi-cell XR клетъчни колби, различни размери клетъчни култури блюда и чинии Centrifuge 5810C Centrifuge чинии Centrifuge 5810C Biosciences BD Biosciences Biorad/Invitrogen Peqlab Stratagene Biorad Omni International Milipore Eppendorf Perkin-Elmer Zeiss Millipore Roth Nalgene Peqlab Eppendorf Biorad Invitrogen Biorad Stratagene Thermo-Scientific Rego Biorad Perkin-Elmer Beckman-Coulter Sarste dt Sarstedt Eppendorf Eppendorf Sarstedt 22
Материали и методи 23 2.1.3 Буфери и разтвори Освен ако не е посочено друго, за приготвянето се използва филтриран H2O Millipore и разтворите се съхраняват при стайна температура (RT). "Таблица 4: Използвани буфери и разтвори Разтвор Бактериална работа Ресуспендиращ разтвор Състав 50 mm Глюкоза 25 mm Tris, pH 8,0 10 mm EDTA, pH 8,0 съхранение при 4 C алкален лизисен буфер 0,2 N NaOH 0,5% SDS буфер за утаяване 25% 5M KAc 15% HCl TE буфер молекулярна биология 50x TAE протеинова биохимия 100% трихлороцетна киселина (TCA ) 0,1 mm EDTA 10 mm Tris (pH 7,5) 242 g Трис основа 57,1 ml ацетат 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) H 2 O до 1000 ml 40 g TCA 20 ml H 2 O 0,5 M Tris, pH 6,8 50 mm DTT 6 g Tris основа 60 ml H 2 O pH 6,8 H 2 O до 100 ml 23
Материали и методи 24 1,5 M Tris 27,23 g Tris основа 80 ml H 2 O pH 8,8 H 2 O до 100 ml 5x SDS буфер за работа 360 g глицин 75 g Tris основа H 2 O до 1000 ml буфер за уравновесяване 1 0,375 M Tris-HCl (ph 8,8) 6 M карбамид 20% глицерол (v/v) 2% SDS (w/v) 130 mm DTT балансиращ буфер 2 0,375 M Tris-HCl (ph 8,8) 6 M урея 20% глицерол (v/v) 2% SDS (w/v) 135 mm йодоацетамид PBST 2000 ml PBS 1 ml Tween20 карбамиден буфер 8 M карбамид 2 M тиокарбамид 2% CHAPS 50 mm DTT полусух блотинг буфер 25 g SDS 5.82 g Tris основа 2,93 g глицин 1,90 ml 20% SDS 200 ml метанол H 2 O и 1000 ml съхранение при 4 C 24
Материал и методи 25 Клетъчен лизисен буфер (RIPA) 150 µl 1 M NaCl 50 µl 1 M Tris-HCl (ph 7.6) 50 µl 20% Nonident P40 (v/v) 25 µl 10% Na дезоксихолат (v/v) 10 µl протеазен инхибитор и 1000 µl H 2 O клетъчен цикъл, апоптоза и стареене ДНК екстракционен буфер 192 ml 0,2 M Na 2 HPO 4 8 ml 0,1% Triton X-100 (v/v) pH 7,8 разтвор на пропидиев йодид 200 µg пропидиев йодид 1 mg RNase 10 ml PBS фиксиращ разтвор 0,25% глутаралдехид (250 µl) 2% параформалдехид (1 g) PBS (pH 5,5; 50 ml) 20x калиев цианид (KC) 820 mg K 3 F (CN) 6 1050 mg K 4 FE (CN) 6 x 3H 2 O 25 ml PBS 40x X-GAL 40 mg 5-бромо-4-хлоро-3-индолил β-d-галактозид 1 ml N, N-диметилформамид 2.1.4 Олигонуклеотиди Използваните олигонуклеотиди Проектиран с помощта на софтуер Primer3 122, ако е възможно. Свойствата на праймерите за хомоложните рекомбинации (по-специално тенденцията към образуване на димери) бяха определени със софтуера Oligoanalyzer 1.2 (Freeware, T. Kuulasmaa, University of Turku, Финландия). 25-ти
Материал и методи 26 2.1.5 Антитела Таблица 5: Първични и вторични антитела, използвани за имуноблоти и FACS приложения. Посочват се целевият протеин, приемникът на произход, използваното разреждане и производителят. Производител на разреждане на гостоприемник на антитела Anti-Mouse-HRP Sheep 1: 10000 GE Healthcare Anti-Rabbit HRP Goat 1: 10000 Cell Signaling Technologies Anti-eIF-5A Rabbit 1: 5000 Novus Anti-DHS Rabbit 1: 1000 Santa Cruz Anti-DOHH Rabbit 1: 1000 Eurogentec Anti-p53 Rabbit 1: 1000 Santa Cruz Anti-p21 Waf1/Cip1 Rabbit 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-AKT Rabbit 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-pAKT Rabbit 1: 1000 Cell Signaling Technologies Anti-Rb Rabbit 1: 1000 клетъчни сигнални технологии Anti-pRB Rabbit 1: 1000 клетъчни сигнални технологии Anti-β-Tubulin Mouse 1: 10000 Oncogene Anti-active-Caspase3- Rabbit 1: 5 BD Pharmingen PE IgG 1 -PE Isotype Mouse 1: 5 BD Pharmingen Контрол 2.1.6 Среда за клетъчна култура Таблица 6: Средите за клетъчни култури, използвани в тази работа, и техният състав. Разтвор Gliommedium Състав Dulbeccos модифициран Eagle среда 4500 mg/l глюкоза L-глутамин 1 mm натриев пируват 1: 100 пеницилин/стрептомицин 10% FCS астроцитна среда DMEM/F-12 4500 mg/l глюкоза 1 mm L-глутамин 26
Материал и методи 27 1 mm натриев пируват 1: 100 пеницилин/стрептомицин 20% FCS DMEM растежна среда Dulbeccos модифицирана среда Eagle 4500 mg/l глюкоза 1 mm L-глутамин 1: 100 пеницилин/стрептомицин 10% FCS (20% FCS за NHAs) замразяваща среда FCS 10% DMSO DMEM-ES среда Dulbecco модифицирана среда Eagle (25 mm HEPES) 15% FCS 2 mm L-глутамин 0,1 mM MEM 0,05 mg/ml нуклеозидна смес пеницилин/стрептомицин (аденозин 1,3 µg/ml; гуанозин 1, 37 µg/ml; цитидин 1,18 µg/ml; уридин 1,18 µg/ml; тимидин 0,38 µg/ml) 1 mm натриев пируват 100 µm 2-меркаптоетанол 1000 U/ml ESGRO-LIF добавка по избор: 150 250 µg/ml G418 KSOM/HEPES среда, pH 7,4 95 mm NaCl 2,5 mm KCl 350 µm KH4PO4 200 µm MgSO 4 среда за MEF (захранващи клетки) DMEM 9% FBS 0,1 mm NEAA 50 U пеницилин/50 µg/ml стрептомицин Ембрионална среда на стволови клетки 27
Материали и методи 28 DMEM 25 mm HEPES 15% FBS 2 mm L-глутамин 0,1 mm NEAA 50 U пеницилин/50 µg/ml стрептомицин нуклеозидна смес (1,3 µg/ml аденозин; 1,37 µg/ml гуанозин; 1, 18 µg/ml цитидин; 1,18 µg/ml уридин; 0,38 µg/ml тимидин) 1 mm натриев пируват 100 µm β-меркаптоетанол 1000 U/ml ESGRO-LIF 28
Материал и методи 29 2.1.7 Използвани клетки Клетъчните линии и първичните клетки, използвани в тази работа, са изброени в Таблица 7. Първичните миши ембрионални фибробласти (MEFs) също се използват като захранващи клетки за култивиране на ES клетки. Таблица 7: Клетъчни линии, използвани в тази работа, както и техните хранителни среди и произход. Среден източник на клетъчна линия Phoenix Eco ϕ - (Модифициран HEK293T, стабилно трансфектиран с два плазмида, кодиращи MML вирусни последователности за "gag", "pol" и "env".) DMEM Станфордски университет (САЩ) U87-MG (Adherent human astrocytoma cell line.), изолиран от астроцитом IV степен на СЗО. Съответни мутации: Изтрит локус Ink4Arf) Среда на глиома ATCC (номер: HTB-14) G55T2 (Прилепнала клетъчна линия на човешки астроцитом, изолиран от астроцитом IV степен на СЗО. Съответни мутации: Изтрит локус Ink4Arf, p53- точкова мутация в ДНК свързващия домейн) Gliommedium Неврохирургия, Университетски медицински център Хамбург-Епендорф; Westphal 1994 NHA (нормални човешки астроцити, първични, диференцирани астроцити от човешката мозъчна тъкан) астроцитна среда Invitrogen (Дармщат; N7805-100) C57BL/6N JM8.F6 клетки (миши ембрионални стволови клетки) DMEM-ES среда W. Skarnes, Wellcome Trust Sanger Институт, Калифорния, САЩ 29
Материал и методи 36 Електрофоретично разделяне на протеини са използвани 12% полиакриламидни гелове на SDS. Стъклените плочи се поставят в отливката и разделящият гел (10 ml) се смесва от следните разтвори: 3,35 ml H 2 O 4 ml 30% акриламид 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) 50 µl 20% SDS 50 μl 10% APS 10 μl TEMED Сместа се излива между стъклените плочи и се покрива с 1 ml изопропанол, докато се полимеризира след около 20 минути. Междувременно се събира гелът за събиране (4%, 5 ml): 3.05 ml H 2 O 0.66 ml 30% акриламид 1.25 ml 0.5M Tris-HCl (pH 6.8) 25 µl 20% SDS 5 µl TEMED След отстраняване на изопропанола и изплакване на отделящия гел с вода, събиращият гел се излива върху разделителния гел и се поставя джобният гребен (10 джоба, дебелина 1,5 mm). След 20 часа гелът се поставя в течащата камера и той се пълни с течащ буфер. Приготвяне на пробата 5x зареждащ буфер и 20x денатуриращ агент (и двата от Fermentas, St. Leon-Roth) се смесват с желания обем протеинов лизат и се допълват до желания обем (10 50 μl) с RIPA буфер. Сместа се вари 5 минути при 95 ° С, за да се денатурират протеините и след това се съхранява върху лед. 36
Резултати 73 AB телесно тегло [g] 30 28 26 24 22 PBS 0,1 mg GC7 0,15 mg GC7 0,2 mg GC7 20 1 3 5 8 10 12 15 17 C 1,0 дни тегло на тумора [g] 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 PBS 0,1 mg GC7 0,15 mg GC7 0,2 mg GC7 Фиг.: 20 Тестова последователност на експериментите за in vivo ксенотрансплантация и ефекта на GC7 в in vivo модел G55T2 ксенографт върху теглото на животните и туморната маса. (А) Тестова последователност на експериментите in vivo с ксенографт с G55T2 клетки. G55T2 клетки се инжектират подкожно дорзално в NSG мишки. След успешен растеж и образуване на тумор, GC7 се прилага i.p. ежедневно. администриран. След седем дни лечение туморите бяха подготвени, претеглени, измерени и консервирани за екстракция на протеин/имунохистохимично оцветяване. Статусът на хипузин (и по този начин ефектът на GC7) се определя чрез 2D Western blot (B) Ход на телесното тегло на мишки NSG след подкожно инжектиране на клетки G55T2 и ежедневно третиране с 0,1 mg, 0,15 mg, 0, 2 mg GC7 или PBS като контрол на разтворителя (средно ± SEM). (С) тегло на тумора след 7 дни лечение с GC7. (Тегло на отделните тумори и средно/кохорта ± SEM). Видимо лечение (напр. Рошава козина, натъртени участъци). BehaV 73 също
Резултати 75 3.3 Създаване на нокаутираща мишка eif5a2 3.3.1 Създаване на целевата конструкция eif5a2 На базата на информацията за последователността на гена eif5a2 (име на миши хомолог на човешкия ген eif-5a) бяха избрани стратегия за клониране и регионът на последователността, който трябва да бъде изтрит. Тази област включва екзони 13 и затваря Фиг.: 22 Схематично представяне на субклонирането чрез хомоложна рекомбинация. Линейният минимален вектор (черен) с хомоложни области (син) към BAC се електропорира в клонинг на E. coli, който носи BAC с ДНК сегмента, който трябва да бъде модифициран (сив). по този начин започва транслацията и лизин 50 в екзон 2, който носи критичната хипузинова модификация. Както е описано в раздел 1.2.7, BAC RP23-361F2 служи като начална точка за клониране на векторната конструкция. Тук е използван методът на рекомбинация (клониране посредством хомоложна рекомбинация) (показан като пример на фиг. 22). Целостта на гена eif5a2 в BAC беше потвърдена за първи път чрез секвениране. След това минималният векторен pstartk се усилва чрез PCR и с помощта на праймерите се добавят рамена от хомология, разположени 5 и 3 от гена eif5a2. PCR продуктът се анализира чрез електрофореза в агарозен гел 75
Публикации и презентации на плакати, създадени по време на тази работа 101 Цялостна мрежа за протеиново взаимодействие на свързаната с рака модификация на хипузин. Sievert H, Venz S, Platas Barradas O, Schaletzky M, Preukschas M, Bokemeyer C, Pörtner R, Walther R, Balabanov S (2011): EMBO Conference Cancer Proteomics 2011 Презентация на плакат Свързан с теломери секреторен фенотип (TASP) си сътрудничи с BCR- ABL за стимулиране на злокачествено разпространение на миши хемопоетични стволови клетки Мелани Брайг, Нора Пелман, Майкъл Преукшас, Дорис Щайнеман, Ан Гомпф, Карл Л. Рудолф, Андреас Шуперт, Стефан Балабанов и Тим Х. Брюмендорф Презентация на постера 101
Приложение 115 8 Приложение2 8.1 Последователности на грунд ef5a2 нокаут конструкция: Име на секвенция за грундиране eif5a2 в pstartk pstartrev-seq1-r pstart-k Seq fwd Праймер за добавяне на хомологични рамена към eif5a2 или към съпротивителните касети A2 primer1 A2 primer2 eif5a2. -за eif5a2-kanneo-loxp-rev eif5a2-kanneo-frt-f eif5a2-kanneo-frt-r сонда грунд 3'-probe3-f 3'-probe3-f По-нататъшно секвениране грундове pws-tk6-ori-f A2-TK6-Ori -r А2-А2 TK6-3'-F-R-TK6-3 "последователност (5'-3 ') tgacagcagacgtgcactgg СТС GGG CCC CAA АТА ATG AT gagcccctcctgtacagcctgggtgttggtgaagggggaatccaagagttacgc GTcgactgaattggttcctttaaagc gagacagacgagttaaggagatacaagaggaaagaaggaagatggaggaa gccgcactcgagatatctagaccca aactgaagatgaggatgcatctcgcccgggaacactgcgaagcttcaaacaattaa ccctcactaaagggcg gtgctgcggattagtgcacttccggcgtgcagagctgcctgcagtcgacttaatacga ctcactatagggctc CTAGGGCCGGCCATTAATaattaaccctcactaaag CTAGTTAATTAAAAGCTTGTTAACtaatacgactcactatag cacacattacatgaattataagg ctgtcccagctcttaactgc gtgagcgaggaagcggaatatatc catccgtcagtctagtaatttcc gggaaatg 115 серия