Повърхностна пасивация за протокол за изследване на едномолекулни протеини (преведено на немски)

Обобщение

Описваме метод за пасивиране на стъклена повърхност с помощта на полиетилен гликол (PEG). Този протокол включва почистване на повърхността, функционализация на повърхността и PEG покритие. Въвеждаме нова стратегия за обработка на повърхността с молекули PEG в рамките на два кръга, което води до превъзходно качество на пасивиране в сравнение със съществуващите методи.

Резюме

Въведение

При извършване на едномолекулно изследване на протеини е важно да се постигне високо качество на пасивация, така че експериментът да не е предизвикан от повърхностно-индуцирана белтъчна неизправност или денатурация 1,2. Докато стъклена повърхност с повърхностноактивни вещества като говежди серумен албумин обикновено се използва за проучвания с нуклеинова киселина с една молекула 3, нивото на пасивация не е достатъчно високо за изследвания на протеини. Стъклена повърхност, покрита с полимер (полиетилен гликол, ПЕГ), превъзхожда пасивирането 4-6. По този начин той е широко използван за проучвания с едномолекулни протеини, откакто е въведен в проучване за флуоресценция на една молекула 7/10. Полимерното покритие обработва няколко повърхностни обработки 7,11,12. Следователно е трудно да се следва цялата процедура без подробни инструкции. Често нивото на пасивация на повърхността варира в зависимост от това кой протокол се спазва. Тук представяме надежден протокол с инструкции стъпка по стъпка, който ще премахне едно от основните тесни места при проучванията с едномолекулни протеини. Моля вижте илюстрация 1 за преглед.

Протокол

1. Подготовка и почистване на слайда

Камерата с микрофлуид се състои от кварцов предметно стъкло и капак. Призма, подобна на микроскопия с пълно вътрешно отражение (TIRF), се изобразява повърхността на предметното стъкло. Следователно е важно кварцовият предмет да се почисти старателно с разтвор на H 2 O, ацетон, KOH и пирана. Многоетапното почистване премахва флуоресцентни органични молекули на повърхността, които пречат на измерванията на флуоресценцията на една молекула. В допълнение, ецването на пирана прави кварцовата повърхност хидрофилна чрез генериране на хидроксилни групи. Свободните хидроксилни групи са за реакцията на амино-силанизиране в етап 3.

Микрофлуидната камера е съставена от кварцов предметно стъкло и устна на капака. Когато се използва призмен тип TIRF микроскоп, повърхността на покривното стъкло не се изобразява. Следователно е достатъчно да се почисти капакът на покрива само с H 2 O и KOH. В случай, че трябва да бъде изобразено покритие (например чрез TIRF микроскопия от типа мишена), препоръчително е покритието да бъде обработено с разтвор на пирани (стъпка 1.7). Имайте предвид, че ако ПЕГилирането на горната повърхност не е с високо качество, то може да действа като мивка за протеини и да доведе до колебания в концентрацията на протеин.

  1. Изплакнете с H 2 O. Поставете капачките на капака (24 x 30, 24 x 40 или 24 x 50 mm 2) в стъклена кювета. Обикновено 5 до 15 покривни фишове се поставят в един съд. Изплакнете покривките 3 пъти с MilliQ H 2 O
  2. Почистване с KOH. Заменете водата с 1 M KOH и облечете с ултразвук покривните фишове за 20 минути или повече.
  3. Изплакнете с H 2 O. Изплакнете покривните стъкла 3 пъти с MilliQ H 2 O, за да премахнете следите от KOH. Продължете със стъпка 3.

3. Аминосиланизиране на фолиа и покривни стъкла

Функционализиране на повърхността на кварцовите предметни стъкла и покривните стъкла с аминова група чрез химиката на амино-силанизацията. Метанолът се използва като разтворител, а оцетната киселина като катализатор за реакцията на амино-силанизиране.

  1. Изплакнете с метанол. Заменете MilliQ H 2 O в съдовете за оцветяване (от СТЪПКИ 1 и 2) с метанол. Съхранявайте стъклата и капаците в метанол до стъпка 3.3. Тъй като примесите в метанола, фолиото и покритието се изплъзват в метанол за ненужно дълго време (например няколко часа) се адсорбират на повърхността.
  2. Пригответе амино-силанизационен разтвор.
    1. Изплакнете Pyrex колба няколко пъти с метанол. Сонизирайте колбите с метанол за 5 минути или повече. Препоръчително е да имате специално бутало, което да се поддържа чисто.
    2. Добавете 100 ml метанол в колбата.
    3. 5 ml оцетна киселина.
    4. 3 ml APTES (3-аминопропилтриметоксисилан) и внимателно се разклаща.
  3. Амино силанизиране. Заменете метанола в съдовете, които съдържат оцветяващи стъкла и покривни стъкла с реакционната смес на аминосиланизация.
    1. Инкубация за 20-30 минути. Ултразвук веднъж за 1 мин по време на инкубацията.
  4. Изплакнете с метанол. Заменете реакцията на еининосиланизация с метанол. Изхвърлете метанола и добавете нов разтвор на метанол. Повторете този процес три пъти.

4. Повърхностна пасивация с използване на полимер (първият кръг)

Пасивирайте покритата с амин повърхност на кварцовите предметни стъкла и покривни стъкла чрез конюгиране на NHS естерен полиетилен гликол (PEG). Тази реакция се провежда за една нощ с концентрация на насищане на разтвора на ПЕГ при рН 8,5.

Съхранявайте ПЕГилираните диапозитиви и покривни стъкла в N 2 при -20 ° C.

  1. Сушещи пързалки и капаци. Разглобете внимателно плъзгача и капака, като го преместите настрани, изплакнете ги с MilliQ H 2 O и ги подсушете с N 2.
  2. Запазете слайдове и капаци. За незабавна употреба следвайте процеса за втория кръг на PEGylation (стъпка 6). За да запазите за по-дълъг период от време, следвайте следващите стъпки.
    1. Поставете чифт пързалка и капак в капачка от 50 ml, така че ПЕГилираните повърхности да са обърнати една към друга.
    2. Затворете частично епруветката, вакуумирайте епруветката и я напълнете с N 2. Тези стъпки спомагат за запазването на ПЕГилираната зона за дълъг период от време. Завийте добре маркуча и го съхранявайте при -20 ° C. Качеството на фолиото остава добро до 3 месеца (Фигура 3, вдясно).

6. Пасивация на повърхността с използване на полимер (втори кръг)

Още един кръг на ПЕГилиране, за да се направи по-плътен слой ПЕГ и също така да се загасят всички останали аминогрупи на повърхността. Използването на къси NHS естери PEG молекули (333 Da) ще бъде ефективно при проникване в съществуващ PEG слой. Препоръчително е да направите този втори кръг на PEGylation точно преди да направите слайдшоу.

  1. Пригответе реакционен буфер. Приготвя се пресният 0,1 М натриев бикарбонатен буфер (рН 8,5). Може да се използва и замразеният разтвор от стъпка 4.2.
  2. Пригответе разтвор за ПЕГилиране. 7 μl от 250 mM MS4-PEG се разтваря в 63 μl от натриевия бикарбонатен буфер.
  3. ПЕГИЛИРАНЕ. Следвайте същата процедура, както в стъпка 4.4. Инкубация за 30 минути до една нощ.
  4. Сушещи пързалки и капаци. Демонтирайте двойката плъзгач и капак, изплакнете ги с MilliQ H 2 O, изсушете ги с N 2 и ги съхранявайте в чиста кутия с пипета. За да сглобите микрофлуидна камера, преминете към стъпка 7.

7. Сглобете микрофлуидна камера

Сглобете микрофлуидна камера с чифт PEG кварцов плъзгач и капак. Двустранната лента се използва като дистанционер. Камерата е запечатана с епоксидна смола и така разтворите се въвеждат през отворите в кварцовия предмет.

Рециклирани кварцови предметни стъкла. Използваните фолиа се рециклират чрез премахване на капаците на капака и двустранната самозалепваща лента.

  1. След употреба камерите се съхраняват в чешмяна вода. Дългосрочната инкубация във вода улеснява демонтирането на камерите.
  2. Варете камерите в чешмяна вода с помощта на микровълнова печка. Използвайте чаша Pyrex. Гответе 10 минути или повече.
  3. Вземете покривните стъкла и двустранната лента с бръснач. Натискате кварцов плъзгач не перпендикулярно на равнината му. В противен случай ще се счупи. Дръжте острието на бръснача извън канала. Не се притеснявайте, в противен случай ще надраска канала.
  4. Изплакнете пързалките с домакински препарат, като ги триете с пръсти.
  5. Плъзнете в стъклена кювета. Обикновено 5 до 15 диапозитиви могат да бъдат дадени в един съд. В 10% домакински почистващ препарат и плъзнете с ултразвук за 20 минути или повече. Изплакнете с голямо количество пързалки за вода.
  6. Отидете на стъпка 1.2.

Представителни резултати

След подреждането на микрофлуидната камера (стъпки 7.1 до 7.6) и преди извършване на стъпка 7.7, препоръчително е да се извърши контрол на качеството на повърхността на ПЕГ.

Ако повърхностната пасивация е извършена успешно, има по-малко от 10 неспецифично адсорбирани протеина на област на изобразяване (25 mm x 25 mm), наблюдавани, когато 1-10 nM флуоресцентно белязан протеин (Фигура 3, вляво) поставете в камерата.

Ако един от етапите на пречистване или реакция не се извърши правилно, броят на неспецифично адсорбираните протеини се увеличава и CCD екранът може да се насити от флуоресцентни сигнали. Например, ако ецването на пирана се пропусне, се наблюдава 100 пъти размера на неспецифичната адсорбция (Фиг. 3а, с в средата вляво за сравнение). Ако се пропусне втората стъпка на ПЕГилиране, се наблюдава приблизително 3 пъти по-голямо количество неспецифична адсорбция (Фигура 3b). Наблюдавано е ниско ниво на ПЕГилиране, когато химикалите с изтекъл срок на годност (напр. APTES се съхраняват при стайна температура в продължение на няколко месеца) (данните не са показани). Качеството на повърхността също пада, ако е изминало значително време, откакто е имало ПЕГилиран тип (Фигура 3а, вижте. Наляво С нали).

Доколкото ни е известно, за първи път са въведени двата кръга на ПЕГилиране за изследвания с единична молекула. Двата кръга на PEGylation гарантират най-високото качество на образуването на PEG слой (Снимка 3b). Превъзходният тип двойно ПЕГилиране се показва на видно място във филмите (вж. 1а филм С Филм-1b). В тези филми фоновите сигнали от флуоресцентни молекули, наблюдавани в разтвор, се използват много по-слаби от двойното ПЕГилиране, което означава, че по този начин протеините се отблъскват от двойния ПЕГилиран слой. Въпреки че процедурата от две стъпки е силно препоръчителна, втората стъпка на ПЕГилиране може да бъде пропусната, ако експериментът ви е поносим за неоптимална пасивация.

повърхностна
Илюстрация 1:. Схема за повърхностна обработка (а) почиства предметно стъкло с разтвор на ацетон, KOH и пирана. Той е PEG функционализиран с APTES и PEG-NHS естер. (Б) Покривният лист се почиства с KOH и, ако е необходимо, с разтвор на пирана. Той е PEG функционализиран с APTES и PEG-NHS естер.

fig2highres.jpg "width =" 500 "/>Фигура 2:. Микрофлуидна камера (а) Едноканална камера. Плъзгачът на микроскопа има две отвори, пробити в него. Той е монтиран с капак с две стъкла от двустранна лента. (Б) Триканална камера. Плъзгачът на микроскопа има шест отвора, пробити в него. Той е монтиран с капак с четири стъкла от двустранна лента.

пасивация
Фигура 3: CCD изображения с маркирани с оцветители протеини, записани в разтвор. (А) CCD изображенията са записани в разтвор чрез призма тип флуоресцентна микроскопия с пълно вътрешно отражение с 60X обектив с 10 nM Cy3-етикет Rep. (Вляво) A-повърхността е създадена съгласно протокола в тази статия. (Средна) Една повърхност беше подготвена в червено съгласно протокола в тази статия, но пропусна гравирането на пирани. (Вдясно) A-повърхността е подготвена съгласно протокола, описан в тази статия, и е съхранявана 3 месеца при -20 ° C под азот. (Б) CCD изображения, записани с 10 nM Cy3-етикет Rep в разтвор. (Вляво) A-повърхността е създадена съгласно протокола в тази статия. (Вдясно) A-повърхността беше подготвена съгласно протокола в тази статия, но вторият кръг на PEGylation беше пропуснат. Мащабна лента = 5 µm.

Филм 1: CCD филми с маркирани с оцветители протеини, записани в разтвор. CCD филмите бяха уловени в разтвор чрез призма тип флуоресцентна микроскопия с пълно вътрешно отражение с 60X обектив с 10 nM Cy3-етикет Rep. Разделителната способност на времето е 100 ms. (А) Направена е повърхност съгласно протокола, представен в тази статия. (Б) A-повърхността беше подготвена съгласно протокола в тази статия, но вторият кръг на PEGylation беше пропуснат. Щракнете тук, за да видите Филм-1а и кликнете тук, за да видите Филм-1б.

Дискусия

Критични стъпки в рамките на този протокол

Важно е повърхността да стане хидрофилна преди реакцията на амино-силанизиране. Това беше постигнато чрез ецване на пирани, което създава свободните хидроксилни групи върху стъклена/кварцова повърхност. Препоръчва се пираната да се гравира върху H 2 O или въздух за дълго време, тъй като хидрофилността на повърхността е изложена и намалява.

ПЕГ молекулите на NHS естера реагират. Препоръчва се да се правят частични количества и да се съхраняват при -20 ° C под азот.Срокът на годност на химическите APTES при стайна температура е нисък. Препоръчително е да го подменяте с нов всеки месец.

Модификации на този протокол

Ако не използвате офорт от пирани по някаква практическа причина, можете да ецвате с KOH за по-дълъг период от време (например за една нощ), което също ще го направи изложен на хидроксилни групи. Ловулката на този алтернативен подход е, че плъзгачът става неизползваем след няколко връщания поради тежките драскотини.

Често се практикува изгаряне на стъклена/кварцова повърхностна пропанова горелка, която е ефективна при отстраняване на флуоресцентни органични материали 7. Тази процедура е включена в този протокол, тъй като е излишно офорт на пирани. Имайте предвид, че тази процедура може да доведе до окисляване на хидроксилните групи. Следователно, тази процедура не трябва да се извършва, ако повърхността е била ецвана с помощта на разтвор на КОН или пирана.

Когато се използва буфер с рН под 7 за изобразяване на единична молекула, конформацията се променя от ПЕГ „гъба“ в „четка“, което показва степента на пасивация. Следователно, ако се използва рН под 7,0, се препоръчва повърхността с дисукцинимидилов естер тартарат 7.

Перспективи

Тази работа осигури надежден протокол за постигане на висококачествена пасивация на повърхността. Този протокол ще бъде полезен за флуоресцентни изследвания с единична молекула, които включват протеини 14 и 15 имунопреципитирани с протеини, както и протеинови комплекси в клетъчните екстракти. Той се използва широко за други едномолекулни техники като силова и въртяща спектроскопия 16 спектроскопия. Той ще се използва и за предотвратяване на адсорбцията на клетките върху повърхността 17.

Протоколът, предоставен в тази дисертация, изисква неговата многоетапна процедура. Като алтернатива се предлагат повърхностна пасивация с липид-ПЕГ-8 и поли-лизин-ПЕГ-9. Тъй като те не изискват никакви химически реакции, това е лесно за изпълнение. Степента на пасивиране обаче не е толкова висока, колкото тази, постигната чрез химическа модификация на повърхността.

Разкриване

Няма какво да разкрием.

Благодарности

SDC, ACH и CJ бяха подкрепени от грантове за стартиране (ERC StG ​​- 2012-309509) от Европейския изследователски съвет. J.-MN беше подкрепена от Националната изследователска фондация (NRF) (2011-0018198) Корея; и Програмата на Pioneer Research Center (2012-009586), финансирана от NRF на Корея чрез Министерството на науката, ИКТ и бъдещото планиране (MSIP). Тази работа беше подкрепена и от Центъра за биологична охрана на здравеопазването на MSIP Корея като глобален граничен проект (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL и J.-HH бяха подкрепени от Програмата за научни стипендии в Сеул на град Сеул, Корея. Етикетираният Rep протеин беше щедър подарък от Dr. Суа Мьонг.