Повърхностна функционализация на наночастиците за целенасочено взаимодействие с биомолекули - PDF
1 Повърхностна функционализация на наночастиците за целенасочено взаимодействие с биомолекули Дисертация за придобиване на академична степен на доктор на природните науки (д-р рег. Нат.), Представена в Катедрата по биология, химия, фармация на Свободния университет в Берлин, подадена от Dipl.-Chem. Мейке Роскамп от Папенбург януари 2010 г.
2 1-ви рецензент: проф. Д-р Сабине Шлехт 2-ри рецензент: проф. Д-р Спор между Ханс-Улрих Райсиг на
4 Dr. Бих искал да благодаря на Йенс Дернеде за приятното сътрудничество в разследването на селектин-свързващите наночастици и разследванията за токсичността на наночастиците. Бих искал да благодаря на Илона Пап за доброто сътрудничество и нейната голяма готовност да помогне. Бих искал също да благодаря на всички сервизни отдели на Института по химия и биохимия, особено на Dr. Йохан Спандл за запознаване с IR спектрометъра и Rita Friese за провеждане на TGA. Бих искал да благодаря на Майкъл Стасиак за коректурата на това произведение и за неговата морална подкрепа по време на писането. Бих искал да благодаря на студентите Нели Ривас, Франциска Бухнер, Катера Хазин, Марейке Ноа и Кристина Людерс за синтетичната им подкрепа. Бих искал да благодаря на най-добрата си приятелка Анет Брунсен за подкрепата, която тя винаги оказваше въпреки голямото разстояние и положителното й влияние върху моите организационни умения. Благодаря на родителите си за подкрепата, на която винаги можех да разчитам. Бих искал да благодаря на Фриц Вилхелм Вернике за разкрасяването на охладителя с рефлукс, малките бележки на бюрото ми и обиколките на града, за неговата подкрепа и търпение.
5 Съдържание Съдържание 1 Мотивация 7 2 Въведение в работната област Синтез и характеризиране на наночастици Синтез на наночастици Характеристика на наночастици Повърхностна функционализация на наночастици Реакции на обмен на лиганди Реакции по периферията на лиганда Адсорбция на молекули върху черупката на лиганда Комбинация от няколко метода на повърхностна функционалностна многофункционална структура Токсичност Преглед на покритата медицинска област 40 3 Резултати и дискусия Синтез на наночастици Синтез и характеризиране на Au колоиди Синтез и характеристика на колоиди Ag Синтез и характеристика на колоиди Au/Ag-сплав Синтез и характеризиране на CdS колоиди Индуцирани от пептид Агрегация на наночастици Структура и свойства на използваните пептиди Заредени наночастици като градивни елементи за електростатичното подреждане Управление и стабилност на наночастиците в буфер VW05-индуцирано подреждане на отрицателно заредени NPs Наночастици-индуцирано образуване на фибрили Селектин-свързващи наночастици 109 5
6 Съдържание Зависимост на инхибирането от степента на сулфатиране Възпроизводимост на стойностите на IC 50 Влияние на структурата на свързващия лиганд Влияние на пептидната връзка Влияние на дължината на веригата Влияние на размера на наночастиците Сравнение на влиянието на изследваните фактори върху IC 50 стойността TEM изследвания Клетъчна токсичност на NP в обездвижването на NP Полимерни влакна Резюме и перспективи Обобщение Експериментална част Съкращения Разтворители и реагенти Синтези NP синтези Реакции на обмен на лиганди Ковалентна модификация на NP синтезите на лигандите Използвани устройства и измервателни методи Диализа Гел електрофореза ЯМР спектрометър IR спектрометър Термогравиметричен анализ (TGA) Предавателен електронен микроскоп/ТЕМ) Спектрометър Конкурентен SPR-базиран анализ на свързване Библиография Приложение 216 6
23 2 Въведение в работната зона Фигура 2.7: Производство на координирани с липаза Au наночастици с помощта на клик химия [77]. Изследване на кинетиката на 1,3-диполярното циклоприсъединяване между азид и алкин на повърхността на златни NPs е извършено от Thode и Williams (схема виж Фигура 2.8) [79]. В допълнение към разтворителя, заместителите на алкин кетона, дължината на веригата на линкера, т.е. H. свързващата част на молекулата, между азидната група и повърхността на NP и плътността на азидните групи на повърхността на частиците. Изчерпателно сравнение между реакцията в разтвор и върху повърхността на частиците не е извършено, но скоростите на конверсия изглеждат много сходни [80]. Интересното е, че промяната в плътността на заемане на функционални групи на повърхността на частиците има по-голям ефект върху получения добив, отколкото всеки друг параметър, разгледан в това проучване. Фигура 2.8: Обща схема за образуване на триазол върху златни NP [79]. 23.
45 2 Въведение в областта на гликоконюгираните златни наночастици [153, 157] и наночастици на кадмиев сулфид [158] и изследвани за техните антиадхезивни свойства или, в случай на полупроводникови наночастици, тяхната пригодност за маркиране на клетки. Целта на тази работна група е по-добро разбиране на въглехидратно-въглехидратните взаимодействия [159], но също така и влиянието на медиираните от въглехидрати процеси на клетъчно-клетъчна адхезия като възпалителния процес. Полимерните частици могат да служат и като носители на моно- и лигозахариди. Haag и сътр. показа през 2008 г., че галактозо-функционализирани полиглицеринови частици са в състояние да инхибират свързването на селектин [160]. В допълнение към зависимостта от степента на функционализиране на частиците, в тази работа е открито ясно подобрение на свързващите свойства след сулфатиране на галактозните остатъци. Това наблюдение съвпада с работата на Linhardt et al. наблюдения, направени за хепарин (виж по-горе). 45
67 []/(10 3 degcm 2 dmol -1 остатък -1) 3 Резултати и обсъждане VW19 RR/nm Фигура 3.25: CD спектри от 50 µm VW19 и 50 µm RR01 при pH 7.4. По-подробно описание на структурите на VW19 и RR01 като функция от концентрацията и стойността на ph може да се намери в публикации от Pagel et al. може да се вземе от [182, 183]. Таблица 3.5 показва изчисления нетен заряд на пептидите като функция от стойността на ph. VW19 е заредена положително под pH 10 и отрицателно заредена над него. RR01 вече се зарежда отрицателно от приблизително Ph 5. Докато VW19 следователно има положителен нетен заряд в неутрални разтвори и по този начин ще влезе в привлекателни електростатични взаимодействия с отрицателно заредени NP, RR01 има отрицателен нетен заряд в този диапазон на pH, което предполага отблъскващи електростатични взаимодействия с отрицателно заредени NP. Обратното е вярно за положително заредените NP. При RR01 се наблюдават атрактивни електростатични взаимодействия в този диапазон на стойности на ph, докато с VW19 се очакват отблъскващи електростатични взаимодействия. Таблица 3.5: Нетен заряд на пептидите VW19 и RR01 при различни ph стойности [179]. ph стойности нетен заряд VW19 [е/пептид] нетен заряд RR01 [е/пептид]
88 3 Резултати и дискусия Фигура 3.43: ТЕМ изображения от координат MUDS. Au-NP (d = 6 nm) при pH 9 в 10 mm Tris/HCl буфер (a) без и (b, c и d) с 10 µm VW05. Докато NPs без пептид бяха изолирани и разпределени сравнително равномерно върху ТЕМ мрежата, ясно присъствие на частиците може да се види в присъствието на 10 µm VW05. В допълнение към NP-пептидните агрегати с размер от няколко 100 nm, някои индивидуално разположени NP могат да бъдат намерени и при тази концентрация и препарат на този пептид. В сравнение с TEM изображенията от предварителните тестове (Фигура 3.40), структурата на агрегатите изглежда има определен ред на къси разстояния на места (вж. Фигура 3.43 г), но няма далечен ред на частиците въпреки значително подобрената дисперсност на частиците. Изсъхването на пробата по време на подготовката на решетката може да доведе до агрегиращи ефекти, които не се проявяват в разтвор. Следователно пробите, приготвени по този начин, позволяват да се правят ограничени заключения относно ситуацията 88 по отношение на агрегираното състояние на компонентите
89 3 Резултати и дискусия в решение. Отстраняването на разтворителя може също да доведе до колапс на подредени структури, ако, както е известно от NP-DNA агрегатите [104], висок процент от структурата е зает от молекули на разтворител. Следователно степента на подреденост на NP-пептидните агрегати в разтвор не е задължително да съответства на тази на такива подготвени ТЕМ изображения. Записите на Cryo-TEM имат предимството, че пробата не се изсушава, а замразява, така че пробата е в състояние, сравнимо с разтвора по отношение на разстоянията между компонентите, налични по време на измерването. Крио-ТЕМ изображенията на координатите на MUDS. Au-NP и VW05 при pH 9 са показани на фигура 3.44 и по същество дават същите резултати по отношение на агрегиращото поведение на NP и степента им на ред в агрегатите, както е показано на фигура 3.43. Фигура 3.44: Крио-ТЕМ изображения с 0,05 µm MUDS координата. Au-NP (d = 6 nm) при ph 9 и различни увеличения (a и b) без VW05 и (c и d) с 10 µm VW05. 89
Следователно, за да може да се работи върху резултати и дискусии, ще е необходима смяна на разтворител. Опитите да се направи това вече не бяха възможни в рамките на тази работа. Фигура 3.46: ТЕМ изображения на смес от 0,05 µm MUDS координата, която е закалена при 80 С. Au-NP и 10 µm VW05. Друго интересно наблюдение беше направено при третиране на утайката с ултразвук. По-рано лилавият, облачен разтвор отново стана бистър и червен чрез лечение с ултразвук. Снимки на суспензия на агрегатите преди и след ултразвуково лечение са показани на Фигура 3.47. След кратко време (приблизително 10 минути) утайката и лилавият цвят отстъпват. Все още не е изяснено дали този процес може да бъде проследен само до механично смилане на агрегатите или индуцирана от ултразвук промяна в пептидната конформация. Фигура 3.47: Снимки на смес от 0,05 µm MUDS координата. Au-NP с 10 µm VW05 (a) преди и (b) след приблизително 20 секунди ултразвуково лечение. 92
94 3 Резултати и обсъждане h, 6 h, 20 h max/nm c (sr05)/M Фигура 3.49: Абсорбционни максимуми от 0,05 µm MUDS координата. Au-NP в зависимост от концентрацията на SR05 при pH 9 (10 mm Tris/HCl буфер) директно след смесване на компонентите и след 6 часа и 20 часа. Имаше атрактивни електростатични взаимодействия между положително заредения пептид SR05 и отрицателно заредените NPs, което доведе до леко увеличаване на абсорбцията в абсорбционните спектри (вж. Фигура 3.49 и спектрите в приложението, раздел 8.1.5) и до леко увеличение на гел електрофорезата Забавяне на NP лентите с увеличаване на концентрацията на пептид (виж Фигура 3.50). За разлика от експериментите с VW05 обаче не може да се наблюдава образуване на утайка и значителна промяна в максимума на абсорбция. Фигура 3.50: Гел електрофореза върху смеси от координирани с MUDS Au-NPs и SR05 при pH 9, горе вляво: агарозен гел, изложен на бяла светлина, долу вляво: агарозен гел, изложен на 254 nm UV светлина, вдясно: таблица със съотношенията на смесване на приложените проби Позицията на джобовете е маркирана с червена линия. 94
129 3 Резултати и дискусия NP11 беше функционализиран с енантиомера на амина, имобилизиран върху NP10 и след това сулфатиран. Стойностите на IC50 на тези два колоида (вж. Таблица 3.10), както за L, така и за P селектина, не се различават значително една от друга. Следователно енантиомерите имат идентични свързващи свойства в този пример. Таблица 3.11 показва стойностите на IC50 на два допълнително функционализирани аминопиран колоида. NP12 и NP13 се различават в присъствието на сулфатна група (маркирана в синьо в таблица 3.11). Докато NP12 представя три сулфатни групи на лиганд, лигандът на NP13 има само две с иначе идентична структура. Таблица 3.11: Стойности на IC50 на сулфатирани Au-NP. Диаметърът на сърцевината на Au NP е около 6 nm. Стойностите, маркирани в зелено, са определени с различна партида NP, но са математически коригирани за тази таблица. Име на инхибитор IC 50 L-селектин IC 50 P-селектин IC 50 E-селектин S3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 460 pm N.I. S3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 300 pm N.I. S 3 Na S3Na Au S 9 N H S3Na NP7 80 pm 130 pm N.I. 129
132 3 Резултати и дискусионна таблица 3.13: IC50 стойности на сулфатирани Au-NP с лиганди, които носят хидрофобни компоненти. Диаметърът на сърцевината на Au-NP е приблизително 6 nm. Обозначение на инхибитора IC 50 L - селектин IC 50 P - селектин IC 50 E - селектин S 3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 130 pm N.I. S 3 Na NP pm 150 pm N.I. Au S 9 N H S 3Na S3Na Au S 9 N H S 3Na NP7 80 pm 130 pm N.I. Интересното е, че координираните с MUDS Au колоиди (NP18) също са способни да инхибират свързването на L- и P-селектина. Недостатък на Au-NP, координирани с MUDS, е тяхната лоша стабилност на агрегация при стойности на pH по-ниски от 9. Разтвори на Au-NP, координирани с MUDS, могат да се получат само при много ниски концентрации, но те могат да се съхраняват само за кратко време. За експериментите, представени тук, се приготвя и изследва 30 nmolar разтвор (на базата на концентрацията на NP) в рамките на 24 часа. Стойностите на IC 50 за MUDS коорд. Au NP с диаметър на сърцевината приблизително 6 nm са изброени в таблица 3.14. За сравнение тук са определени и стойностите на IC50 на NP7 и на MUD сулфатно-координираните Au NP (NP19) с диаметър на сърцевината приблизително 6 nm. Синтезите на NP18 и NP19 вече са представени в раздел (схема за обмен на лиганди виж Фигура 3.29). 132
134 3 Резултати и дискусия NP с координиран с цитрат Au NP, който също представя карбоксилатни функции на повърхността им. Докато MUDS координират. Au-NP за L- и P-селектин IC50 - стойностите в пикомоларния диапазон не могат да инхибират свързването на селектин в присъствието на цитратната координата. Au NP могат да се наблюдават. В допълнение към отрицателно заредената подструктура, следователно трябва да бъдат изпълнени допълнителни изисквания, за да се постигне добър свързващ афинитет. Не е достатъчно да се предложи отрицателно заредена частица в определен диапазон от размери за свързване. Поведението на свързване на цитратната координата. Au-NP вече показва, че измерените резултати не се дължат на неспецифични взаимодействия между селектина и наночастиците. Фигура 3.71 показва два допълнителни примера за NP, които не показват никакъв инхибиторен ефект в анализа на конкурентното свързване. а) б) Au N N Au S H Фигура 3.71: а) DMAP координата. Au-NP и b) Pol1-координат. Au NP 9.
21 Дори при високи концентрации на NP, след инкубация на несвързващите Au NP с L-селектин, се получава относително свързване от 100% и по този начин не се получава инхибиране. В резултат на това няма измерими, неспецифични взаимодействия между селектина и НП. В обобщение, IC50 стойностите в пикомоларния диапазон са получени за всички полисулфатирани NP, изследвани тук, независимо от структурата. Структурата на лиганда и по-специално пространственото разположение на групите, налични за свързване към селектина, оказва силно влияние върху свързващите свойства на NP. С по-сложни структури може да се получи и селективно поведение на свързване с L- и P-селектин. Р селективността се проявява особено при лиганди, които са лесно податливи и стерично по-малко взискателни. Простите структури инхибираха и двата селектина със сходни IC50 стойности. Надеждна прогноза за 9 Полимерът Pol1 е синтезиран от Marie Weinhardt. 134