Остра мозъчна травма при мишки, последвана от надлъжен двуфотонен образен протокол (в превод на
Обобщение
Острата мозъчна травма е сериозно нараняване, което до момента не е получило адекватно лечение. Мултифотонната микроскопия позволява надлъжно изследване на процеса на развитие на остра мозъчна травма и изследване на терапевтични стратегии при гризачи. Два модела на остра мозъчна травма, изследвани с помощта на in vivo двуфотонно изображение на мозъка, са демонстрирани в този протокол.
Резюме
Въведение
Острата мозъчна травма е значителен проблем за общественото здраве с висока честота на наранявания при автомобилни катастрофи, падания или грабежи и високо разпространение на хронични инвалидизации. Терапевтичните подходи за лечение на мозъчно увреждане остават изцяло симптоматични, като по този начин ограничават ефективността на предклиничните, хирургичните и интензивните грижи. Това прави социалните и икономическите ефекти от увреждането на мозъка особено тежки. По различни причини повечето клинични изпитвания не успяха да демонстрират подобрение на възстановяването след мозъчно увреждане, използвайки нови терапевтични подходи.
Животинските модели са жизненоважни за разработването на нови терапевтични стратегии за фаза, в която се прогнозира ефикасността на лекарството при пациенти с мозъчни наранявания. Понастоящем съществуват няколко утвърдени животински модела на наранявания на главата, включително контролиран удар на кората, удар с течност с перкусия 2, динамична деформация на кората 3, спад на теглото 4 и фото нараняване. Използвани са редица експериментални модели за изследване на някои морфологични, молекулярни и поведенчески аспекти на свързаната с травма на главата патология. Въпреки това, нито един животински модел не е напълно успешен при валидиране на нови терапевтични стратегии. Разработването на надеждни, възпроизводими и контролирани животински модели на мозъчно увреждане е необходимо за оценка на сложните патологични процеси.
Тук предлагаме да се изследва методът на стереотаксично убождане с игла на спринцовка, който може да се комбинира с едновременно прилагане на локални лекарства, като усъвършенстван модел за локално мозъчно увреждане и като инструмент за изследване на патофизиологичните последици от острата травма в мозъка на бозайниците in vivo.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
Всички представени тук процедури са проведени в съответствие с местните насоки за грижа за животните (Финландският закон за експериментите с животни 62/2006). Лиценз за животни (ESAVI/2857/04.10.03/2012) е получен от местната власт (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Възрастни мишки, на възраст 1-3 месеца, с тегло 24-38 g, бяха настанени в отделни клетки в сертифицираното университетско съоръжение за животни и снабдени с храна и вода ad libitum.
1. Изобразяване на мозъчни наранявания през мозъчен прозорец
2. Мозъчна травма Изобразяване чрез изтънен череп
Създайте диаметър от 0,5 до 1,5 мм. Използвайте сгъстен въздух, за да отстраните костните фрагменти по време на пробиването. Извършвайте пробиването периодично по време на процедурата за изтъняване, за да избегнете прегряване от триене. Охладете тренировката с разтвора при стайна температура и нанасяйте редовно буфер върху разредената зона, за да абсорбира топлината.
ЗАБЕЛЕЖКА: За да избегнете повреда на кората, не пробивайте големи площи (> 1,5 мм), с изключение на тънък слой (Изисква се абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
1) хроничен мозъчен прозорец и 2) изтъняване на черепа за посттравматично изобразяване на мозъка при трансгенни мишки: оптимизирахме две оперативни процедури. Схематично представяне на изследваните продукти е в Фиг. 1 показани. Травматично убождане през стоманена игла с външен диаметър 0,3 mm (30 G) в сондажния кладенец (Фигура 1А) разстроен. Успешната подготовка на прозореца на черепа позволява изображения на дълбочини до 650 µm под повърхността на пиа (Фигура 1Б), докато изтъняването на черепа има тенденция да има ограничение от около 300 µm (1С) налагат, както при 3D реконструкцията Thy1-YFP-устойчиви H миши кортикални пирамидални клетки.
Травмата с убождане води до елиминиране на дендритите и разрушаване на капилярните мрежи в контролиран обем на мозъчната кора. През първите два дни площта на лезията се увеличи и травмата предизвика дендритни мехури и образуването на дендритни ретракционни луковици в зоните на перилезия, както е показано при използване на in vivo многофотонна микроскопия (Фиг. 2) наблюдаваното.
Извършихме активиране на изображението на череп Forst и миграция на микроглиални мишки CX3CR1-EGFP веднага след нараняване (Фигура 3А). Изображенията SHG предлагат ценен инструмент за точно определяне на мястото на нараняване (3B) да се разграничи. Извънклетъчните матрични молекули, които произвеждат SHG сигнали, са силно обогатени в мозъчен паренхим при убождането. На първо място се извикват фини микро процеси, след което клетките на микроглията мигрират до границата на мястото на нараняване (Фигура 3А).
За да оценим възможни наранявания, причинени от въвеждане на пипета от тънка стъкло и доставяне на багрило, ние извършваме in vivo експерименти с двуфотонна микроскопия със микроинжекция със сулфородамин 101 при мишки Thy1-YFP-H без мозъчна травма. В Фиг. 4 Показаните представителни изображения показват мястото на микроинжектиране 3 часа след инжектирането. Следата от вкарването на пипета в менингите от SHG (4А) разпознават визуализирано. Астроцити със сулфородамин 101 чрез инжектиране (Фиг. 4Б) въведена маркирана. Дендритите YFP не изразяват никакви морфологични признаци на нараняване като образуване на мехури или счупване на крушки под промотора Thy1 (Фигура 4 В) да демонстрира.
Фигура 4. Изследване на тъканно натоварване, направено чрез инжекционен разтвор чрез стъклена микропипета. А. Една следа (показана с пунктирана линия) при визуализация на SHG на менингите 3 часа след инжектирането. Б. Астроцити, маркирани със сулфородамин, въведени от инжекцията. ° С. Дендритите експресират YFP под промотори на Thy1. Д. Комбинирано изображение на А. (SHG - сиво), Б. (Астроцити - червено), ° С. (нервни дендрити - жълто).
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Дискусия
Мозъчната травма е внезапно, непредсказуемо събитие. Тук описваме животинския модел, който възпроизвежда спектър от кръв при хора след мозъчно увреждане като невродегенерация, елиминиране на дендрити, мозъчен оток, глиални белези, кръвоизливи в мозъчната кора, свързани с фокални субарахноидални кръвоизливи и повишена пропускливост на наблюдаваните патологични промени -Мозъчна бариера. За да се изследва първичната и вторичната патогенеза, както и възстановяването след травма, този модел на нараняване се комбинира с надлъжна in vivo визуализация на фини невронни и глиални структури. Използвани са трансгенни миши линии, които експресират флуоресцентните протеини microglia (CX3CR1-EGFP) 9 в неврони (Thy1-YFP-H) 7, астроцити (GFAP-EGFP) 8, или. В допълнение използвахме изображение на второ хармонично поколение (SHG) и натоварване на астроцити със Sulfarhodamine 101 10.
Моделът, описан тук, рекапитулира типа проникване на мозъчно увреждане. Следователно, едно ограничение на настоящия модел е, че той не предоставя информация за механизмите на затворена травма на главата. Наскоро Schwert и съавтори съобщават резултатите от многофотонното изобразяване на поведението на клетките в периконтузионната кора 6. Като се има предвид, че затворената травма на главата е често срещан медицински случай, методологичният подход, докладван от авторите, е много обещаващ за традиционните изследователски методи в областта на мозъчните ефекти. Травма 11 добавка.
Използвахме както хроничния прозорец на черепа 12, така и препаратите за изтъняване на черепа 13, за да изследваме клетъчното поведение при посттравматични условия в живите мозъци. И двата метода имат определени предимства и ограничения. По този начин, хроничният мозъчен прозорец осигурява по-добра резолюция, подобрена оптична дълбочина на проникване в мозъчната тъкан и удобство за множество изображения. Обратно, по-малко вероятно е да предизвика възпаление в мястото на изобразяване на изтъняване на черепа и, може би по-важното, позволява многократно прилагане на лекарства и оцветители. Има някои примери за фармакологични агенти, които ще бъдат използвани в този тип експеримент маса 1 посочено.
Таблица 1. Фармакологични агенти и оцветители за инжектиране при модел на увреждане на кората.
Широк спектър от биохимични събития, които са много важни при физиологични и патологични условия, могат да бъдат изследвани с химични инхибитори, флуоресцентни индикатори и мутирал протеин, въведени чрез вирусни конструкции. Ползите от избора на конкретни времеви прозорци, осигурени от препарата за изтъняване на черепа, могат да бъдат много подходящи за тези изследвания.
В настоящото проучване генерирахме втория хармоничен сигнал за демаркиране на мястото на нараняване. Алтернативно, границите на мястото на нараняване могат да бъдат посочени от слабо разсейващо се флуоресцентно багрило, например флуоресцентен конюгат декстран с високо молекулно тегло (2 милиона далтона).
Наскоро Schaffer и колеги 14 използваха хроничен прозорец за повторно отваряне на производството с череп за повторно доставяне на флуоресцентни багрила върху кората на мишката. Вероятно повторното отваряне на прозореца на черепа може да повлияе неблагоприятно на прозрачността на мозъчната тъкан. Освен това е трудно да се предвиди ходът на възпалението, предизвикано от обратното захващане, което може да повлияе на възстановяването на съединителната тъкан.
Основно предимство на производството на изтънен череп е способността да се доставят терапевтични съединения (и други материали, изискващи локално инжектиране в мозъчна тъкан) многократно по време на прогресирането на травмата, без да се усложняват артефакти (например, без възобновяване на мозъчния прозорец).
В случаите, при които не се изисква директен достъп до нараненото място, препоръчваме разреждането на изтънената област на черепа със стъклен капак, както е описано в хартията и стоманата върху полиран черепен препарат от Клайнфелд и неговите колеги 15. Това може да се направи с следните незадължителни процедури. Поставете малка капка агароза (1,5%) върху изтънената област на черепа, изчакайте тя да се желира, премахнете ненужната агароза, така че просто я оставете на мястото на нараняване. Агарозата трябва да предпазва мястото на нараняване от външни влияния. Изсушете изтънения връх на главата със сгъстен въздух. Оставете малко количество полиакрилно лепило върху малко парче от капак № 0 и го поставете върху изтънената област на черепа. Лепилото предотвратява повторното израстване на полиакрилни кости и съединителна тъкан и по този начин запазва изтънения череп запазен под прозореца.
Комбинацията от тези процедури дава възможност за изследване на остри и хронични посттравматични процеси и доставя лекарства локално или системно и пряко наблюдение на ефектите от лечението. Използването на двойни или тройни трансгенни линии на мишка също може да бъде полезно, отделни изделия, за едновременното показване на множество посттравматични процеси, като белези на глиални клетки и възстановяване на невронни клонове. Очакваме, че нашите модели на остри мозъчни увреждания, изследвани с помощта на интравитална двуфотонна микроскопия, за да се окажат плодотворни за кандидатстване за тестване.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Разкриване
Авторите няма какво да разкрият.
Благодарности
Ние сме дълбоко благодарни, че Dr. Франк Кирхоф за предоставяне на щамове на мишки GFAP-EGFP и CX3CR1-EGFP. Работата беше подкрепена с безвъзмездни средства от Центъра за международна мобилност на Финландия, Tekes, Финландското висше училище по неврология (FGSN) и Академията на Финландия.