Общество за диференциация и пролиферация на Макс Планк
Отдел за развитие и ремоделиране на сърцето (проф. Д-р д-р Томас Браун)
MPI за изследване на сърцето и белите дробове, Бад Наухайм
(1) Диференциация и пролиферация на клетките по време на развитието и регенерацията
Молекулен контрол на диференциацията и регенерацията в увреденото и застаряващо сърце
Според общата доктрина, сърцето за възрастни се състои от диференцирани кардиомиоцити (клетки на сърдечния мускул), които вече не са в състояние да се делят. Тъй като човешкото сърце може да работи непрекъснато и ефективно в продължение на десетилетия, се предполагаше, че отделните кардиомиоцити също оцеляват през този период без големи промени. Различни проучвания обаче показват, че стареенето и увреждането на сърцето неизбежно водят до загуба на клетки чрез така наречената програмирана клетъчна смърт (апоптоза) с последващи тъканни промени (некроза). От това може да се заключи, че възрастните кардиомиоцити все още имат остатъчен капацитет за самообновяване и че това е от съществено значение за поддържане на нормалната сърдечна функция. Засега не е известно кои сигнали и процеси определят баланса между клетъчната смърт, оцеляването на клетките и клетъчното делене.
Работна група към MPI за изследване на сърцето и белите дробове в Бад Наухайм търси растежни фактори, които биха могли да контролират този деликатен баланс. Един от тези фактори е възможно BMP-10, нов член от семейството BMP (костни морфогенетични протеини), който се експресира специално в мускулни топки, наречени "трабекули" в сърдечната тъкан и атриума на развиващото се сърце на мишката. Хомозиготните мутантни мишки BMP-10 развиват ранна дисфункция на сърцето, което може да се дължи по-специално на липсата на трабекулация, което води до умиране на мутантните ембриони между E10.5 и 11.5 p.c. (след копулация) води. В тъканната култура BMPs също предпазват кардиомиоцитите от апоптоза. Тъй като BMP-10 е силно експресиран в сърцата на възрастни мишки и хора, изследователите ще анализират ролята на BMP-10 в оцеляването и стареенето на кардиомиоцитите при трансгенни модели на мишки. Те очакват, че по-задълбоченото разбиране на ролята на BMP ще доведе до нови терапевтични методи при сърдечни заболявания (Фиг. 1).
Ремонтните процеси в стареещото или увредено сърце се характеризират с генерирането на нефункционална белези. Регенерацията на застаряващите сърца е - както е обяснено по-горе - невъзможна поради ограничаването на способността на клетките на възрастните сърдечни мускули да се делят и липсата на достатъчно количество сърдечни стволови клетки. Следователно учените от MPI се опитват да пробият митотичния блок на кардиомиоцитите, като манипулират клетъчната техника. По-специално, те изследват ролята на транскрипционните фактори E2F и каталитичната субединица на ензима теломераза при инициирането на клетъчния цикъл и потенциалното използване на доминиращи отрицателни версии на p53 и p73 за предотвратяване на апоптозата на клетките на сърдечния мускул.
Изследователи: Изабела Пиетровска, Томас Кубин, Жипей Лю
В горната част на снимката се показва сърце на мишка, след като LAD, коронарен съд, е лигиран. Лигирането на артерията води до ясно видим масивен инфаркт. В долната част на снимката в сърцето е инжектиран аденовирус, който изразява репортерен ген, който може да бъде видим в прост син цвят. Генният трансфер в сърдечната тъкан представлява бъдеща възможност за лечение на сърдечна недостатъчност.
Сърдечна регенерация на зеления тритон (Notophtalmus viridescens)
Някои организми имат способността да индуцират клетки, които са постмитотични при други видове, да влязат отново в клетъчния цикъл и дори да регенерират цели органи или части от органи. Добре известен представител на това семейство животни е тритонът Notophtalmus viridescens, който е известен със способността си да регенерира ампутирани крайници или опашки и някои други структури. N. viridescens е един от малкото гръбначни животни, който също е в състояние да регенерира сърдечната мускулна тъкан (Фиг. 2). Екип от учени от MPI в Бад Наухайм сравнява експресионните профили на неповредена и регенерираща сърдечна тъкан, за да идентифицира молекули, които контролират регенеративния капацитет на сърцето на тритона. Данните от този скрининг се сравняват с резултатите от подобни екрани на миши модел на миокарден инфаркт. Досега изследователите са генерирали ДНК чипове със 100 000 кДНК и са ги използвали за идентифициране на гени, които показват диференциална експресия в регенериращото и почиващото сърце. Подробният функционален анализ на молекулярния път, който определя сърдечната регенерация при тритоните, е следващата стъпка, която в момента се прилага с помощта на различни подходи.
Изследователи: Тило Борчад, Джулия Крузе, Томас Кубин, Томас Бьотгер, Рене Цимерман
Показан е „тритон с червени точки, зеленикав воден тритон“ (Notophtalmus viridescens), при който част от сърцето е била повредена (област, очертана в бяло). Интактните клетки на сърдечния мускул, които практически липсват в увредената област, са оцветени в зелено. За разлика от хората, тритонът може да възстанови увредената област и напълно нормално сърце дори в зряла възраст.
Идентифициране на гени, които контролират диференциацията на кардиомиоцитите
В миналото са идентифицирани различни гени, които допринасят за диференциацията на кардиомиоцитите и за морфогенезата на сърцето. Въпреки това е много вероятно значително по-голям брой гени да играят роля в специфичната форма на сърцето. Всеобхватни функционални подходи за идентифициране на такива гени все още не съществуват за бозайниците. Изследователска група към MPI прилага стратегия за широк екран на генома, основана на диференциацията на ембрионалните стволови клетки. Тя използва сложни ретровирусни siRNA библиотеки, за да идентифицира гени, които играят решаваща роля в диференциацията на кардиомиоцитите. Идентифицираните гени се използват при диференциацията на ембрионални стволови клетки (ES клетки) инвитро чрез образуване на ембриоидни тела (EBs; Фигура 3В) и in vivo с помощта на тетраплоидни агрегирани химери.
Изследовател: Андре Шнайдер, Томас Бьотгер, Дитмар фон дер Ахе
Диференциация на ембрионални стволови клетки (ES) в кардиомиоцити след третиране на ембрионалните тела (EBs) с растежен фактор FGF-2 в продължение на три дни. A: недиференцирани клетки; Б: Ембрионални тела след 3 дни лечение с FGF-2; C: Sarcomere MyHC (MF-20) положителни кардиомиоцити, диференцирани от ембрионални тела след третиране с 3ng/ml FGF-2.
Стареене на сърцето и оксидативен стрес: SIR гени и контрол на енергийния метаболизъм
Реактивните видове кислород (ROS = кислородни радикали) причиняват множество дегенеративни промени в клетката и водят до преждевременно стареене на клетките. Като цяло натрупването на ROS се счита за основната причина за повишено стареене на клетките. Изглежда, че тъканите, състоящи се предимно от постмитотични клетки, са особено податливи на увреждане от ROS, тъй като имат само ограничен потенциал за регенерация. Засега точните връзки между оксидативния стрес и стареенето не са напълно известни Фиг. 4. Ясно е обаче, че повишеният оксидативен стрес води до нестабилност в енергийния метаболизъм. Небалансираният енергиен метаболизъм вероятно води до намалена активност на семейството гени SIR (регулатор на тиха информация). Предполага се, че SIR гените инактивират специални хроматинови домейни (чрез деацетилиране на зависими от NAD хистони) и по този начин упражняват защитна функция. Според тази идея свръхекспресията на SIR2 в дрождите (Saccharomyces cervisiae) до значително увеличаване на експлоатационния живот.
Учените от MPI за изследване на сърцето и белите дробове са генерирали различни линии на мишката, които им позволяват да изследват ролята на оксидативен стрес, стареене и инактивиране на хроматин. За тази цел те са конструирали условно активен алел на SOD2 (супероксиддисмутаза), който позволява инактивирането и активирането на гена в определени моменти в сърдечния мускул. Във втора поредица от експерименти кДНК SIR2 се свръхекспресира изкуствено в сърцето. Освен това те изследват ефекта на нормалната калорична и хипокалорична храна върху оксидативния стрес и стареенето на клетките, като използват съответните профили на експресия на кардиомиоцитите. Те също така анализират връзката между оксидативния стрес и инактивирането на генния хроматин чрез кръстосване на мишки с дефицит на SOD2 с тези, при които SIR2 е свръхекспресиран.
Изследователи: Ева Бобер, Сузане Вайнлих, Олеся Вакрушева
Ензимът „манганизирана супероксиддисмутаза (MnSOD)“ увеличава степента на преживяемост на фибробластите при хипероксични условия. Контролните фибробласти и тези, които свръхекспресират MnSOD, се култивират при нормални (20% O2 = "нормоксия") и хипероксични (85% O2 = хипероксия) условия. Фазово-контрастните изображения документират значително по-висока степен на оцеляване при оксидативен стрес в свръхекспресиращите MnSOD клетки. Свръхекспресията на MnSOD може да се разпознае по зелената флуоресценция (лявата страна и центъра). Дясна страна на снимката: Синьото оцветяване документира индуцираното стареене (стареене) на клетките след приложение на 200nM доксорубицин. В клетките с свръхекспресия на MnSOD до голяма степен се предотвратява стареенето.
Контрол на миграцията на мускулни клетки-предшественици чрез индуктивни и автономни сигнали от клетката
Миграцията е важно свойство на миогенните клетки (мускулни предшественици) по време на органогенезата и регенерацията на органите. В миналото изследователите са успели да покажат, че генът Homeobox Lbx1 регулира миграцията на мускулни клетки-предшественици в крайниците по автономен за клетките начин. Резултатите им доказаха, че Lbx1 е ключов регулатор на миграцията на мускулните предшественици и е необходим за целенасочената миграция на предшествениците на мускулите на задните крайници и мускулите екстензор на предния крайникФиг. 5). Използвайки cDNA изваждане на хетерозиготни и хомозиготни мутантни Lbx1 клетки, учените успяха да идентифицират различни предполагаеми целеви гени на Lbx1. В момента е в ход функционалното изследване на тези гени. Освен това работната група изследва каскади за предаване на сигнали, които са необходими за клетъчната мобилност и миграцията на мускулни клетки-предшественици при възрастни мишки и пилешки ембриони.
Изследователи: Стефан Гюнтер, Светлана Устанина
Дезактивирането на гена на Homeobox Lbx1 води до спиране на миграцията на мускулни предшественици в крайниците. Бактериален репортерен ген е въведен в гена Lbx1 чрез целенасочена мутагенеза. Този генетичен трик от една страна изключва активността на гена Lbx1, а от друга прави клетките видими, в които Lbx1 обикновено е присъствал. Първият и третият ред показват хомозиготни мутанти, вторият и четвъртият ред хетерозиготни мутанти. На изображения c и i е ясно видимо, че клетките на предшествениците на мускулите, маркирани в синьо, не могат да мигрират в задния крайник, а „да се забият“ в багажника.
Регулиране на телесното тегло и сърдечната функция чрез невронни bHLH гени
Като част от скрининг за невронално експресирани bHLH гени (транскрипционни фактори, които съдържат основен домен на спирала-верига-спирала), изследователите от MPI в Бад Наухайм успяха да идентифицират редица различни кДНК и гени преди няколко години. По-специално, те анализират двата гена NSCL1 и NSCL2. Въпреки че инактивирането на NSCL1 не води до забележима невронална дисфункция, мутиралите мишки на NSCL1 умират преждевременно, вероятно в резултат на сърдечни дисфункции, които могат да бъдат предизвикани от вегетативна дисфункция. Мишките с дефицит на NSCL2 също страдат от множество невроендокринни нарушения (Фиг. 6). Комбинираното инактивиране на двата гена води до намалена пролиферация на нервните клетки и нарушена диференциация в обонятелния епител.
Изследователите се интересуват от молекулярните и физиологичните процеси, които са в основата на тези фенотипове. Особено внимание се обръща на анализа на целевите гени NSCL1 и NSCL2 и връзката между клетъчната пролиферация и диференциация. Един от фокусите на бъдещите дейности в този проект е изследването на функцията на NSCL2 в възрастния организъм и механизма на нарушения на сърдечния ритъм и вегетативни дисфункции при мутанти на NSCL1.
Изследовател: Карън Рушке, Томас Шмит
Затлъстяване поради дисфункция на нервната система: Насоченото инактивиране на основния транскрипционен фактор спирала-спирала-спирала NSCL-2, който се експресира в неврони, води до изразено затлъстяване при мишки. Външният вид на мишката прилича на човешкия синдром на Prader-Willi по отношение на неговия молекулярен подпис.
(2) Подобряване и ускоряване на регенерацията на тъканите: възстановяване и заместване на увредени клетки на сърцето и скелетната мускулатура
Регенеративната медицина е нова и вълнуваща област в биологичните и медицински изследвания. Той се основава директно на резултатите от основни изследвания, свързани с диференциацията и развитието на клетките. По-новите открития предполагат, че предишните решения, взети от клетките, не са необратими, но могат да бъдат обърнати и променени. Такава „динамична концепция за намиране на идентичността“ на клетката се основава на идеята, че поддържането на клетъчен фенотип изисква непрекъснато регулиране. По принцип това означава, че трябва да е възможно да се препрограмира диференцираните клетки и по този начин да се засилят регенеративните свойства на тъканите и органите.
Избор и манипулация на мезенхимни стволови клетки за генериране на миобласти и кардиомиоцити
Мезенхимните стволови клетки (MSC) се срещат в стромата (поддържаща тъкан) на различни органи. Костният мозък съдържа MSC, които могат да поемат свойства на различни клетъчни типове, включително сърдечни и скелетни мускули и невроектодермални клетки (Фиг. 7). Използването на генетично маркирани MSCs, получени от костен мозък, позволи на изследователите да получат представа за потенциала за диференциация на MSC in vivo да се приема след инжектиране в ранни миши ембриони. Чрез комбиниране на специфични стратегии за генетичен подбор и индукционни протоколи е възможно да се получат относително еднородни клетъчни популации, които имат характеристиките на мускулните клетки и могат, ако е необходимо, да се използват за терапевтични цели.
Освен това групата работи по оптимизацията на методите за ефективен подбор и разширяване на MSCs за генериране на миобласти и кардиомиоцити. Те също така определят терапевтичния потенциал на тези клетки. Подобен подход обаче може да бъде успешен само ако е възможно да се научи повече за сигналите и процесите, които са необходими за определяне и диференциране в различни клетъчни линии.
Изследовател: Fikru Belema Bedada, Kerstin Broich
Изглежда, че мезенхимните стволови клетки приемат своята идентичност за предпочитане чрез сливане със съществуващите скелетни и сърдечни мускулни клетки. Това заключение е резултат от показания експеримент, при който мезенхимните стволови клетки са маркирани с червена боя и са култивирани със зелени мускулни клетки върху мембрана с пори с различни размери. Мезенхимните стволови клетки могат да експресират мускулен протеин (оранжев) само ако размерът на порите на филтъра е достатъчен, за да позволи на клетките да преминат свободно. Ако това не беше гарантирано, в мезенхимните стволови клетки не могат да бъдат намерени мускулни протеини.
Сателитни клетки: контрол на пролиферацията, излизане от клетъчния цикъл и диференциация по време на регенерация на тъканите
Сателитните клетки са стволовите клетки на скелетните мускули. Те се намират между базалната ламина и плазмената мембрана (сарколема) на миотръбите, където се активират по време на тренировка, мускулни наранявания или заболявания, които увреждат мускулните влакна. Учените анализират механизмите, които контролират пролиферацията, излизането от клетъчния цикъл и диференциацията на сателитните клетки по време на регенерацията на мускулната тъкан (Фиг. 8). Чрез трансплантация на генетично маркирани клетки от миши мутанти с целеви мутации в семейството на гени на растежен фактор на FGF, те показаха, че миогенните стволови клетки са автокринно зависими от FGF. Използването на доминиращи отрицателни ретровируси предполага, че FGFs инициират ras- и ral-зависима каскада, която инициира клетъчна миграция.
Изследователите определят потенциала на генерични и генетично модифицирани растежни фактори за терапия и профилактика на заболявания на скелетната мускулатура при трансгенни животни като предклиничен модел. Използват се два различни подхода: 1) генериране на трансгенни животински модели за анализ на функцията на растежните фактори, предимно FGF, миостатин и SF/HGF; 2) Избор на генетично модифицирани базирани на миостатин растежни фактори с модифициран биологичен спектър. Анализът на растежните фактори по време на регенерацията се подкрепя от експерименти, които се занимават с функцията на клетъчно-автономните процеси при активиране и поддържане на сателитни клетки.
Изследователи: Светлана Устанина, Михал Милкарек, Стефан Гюнтер, Андре Шнайдер
Сдвоеният кутия ген Pax7 е отговорен за поддържането на пула на мускулните стволови клетки. Синият цвят показва активността на гена Pax7 в сателитни клетки, които са разположени върху изолираните мускулни влакна в „сателитна позиция“. При мутантите на мишки Pax7 броят на сателитните клетки е малко намален по време на младостта на мишката (P 11), но бързо намалява с увеличаване на възрастта (P 60). В допълнение, Pax7 мутантните сателитни клетки показват загуба на експресия на CD34 маркера на стволови клетки.