Нов метод за изясняване за визуализиране на дегенерация на жлъчните пътища по време на чернодробна метаморфоза в морето
Обобщение
Морската минога губи жлъчния мехур и жлъчните пътища по време на метаморфоза, процес, подобен на човешката жлъчна атрезия. Модифициран е нов метод за фиксиране и изясняване (CLARITY), за да се визуализира цялото жлъчно дърво с помощта на лазерна сканираща конфокална микроскопия. Този метод предоставя мощен инструмент за изследване на дегенерация на жлъчката.
Резюме
Въведение
Морската минога се развива през три отделни етапа на живот 1,2. Ларвите на миногата (L) прекарват повече време в дупки като бентосни хранилки за филтри. След като преминат през седем метаморфни етапа на драматични промени във външната морфология и реорганизация на вътрешните органи 3, получените млади (JVs) навлизат в паразитен стадий, през който се хранят с кръвта и тъканните течности на рибата гостоприемник, l увеличаване на телесната маса на повече от 100 пъти. След 1,0 до 1,5 години хранене с рибите гостоприемници в океана или големите езера, възрастните спират да се хранят в началото на пролетта и мигрират в реките, за да хвърлят хайвера си и да умрат 1,2.
По време на метаморфоза черният дроб на морската миноза губи жлъчния мехур и цялото жлъчно дърво, еволюционен мутантен фенотип, който имитира човешко детско заболяване на атрезия на жлъчните пътища. Детската билиарна атрезия е рядко детско чернодробно заболяване със сериозни медицински усложнения 4,5,6,7,8,9,10, но патогенезата и етиологията на атрезия на жлъчните пътища са до голяма степен неизвестни 4. Пациентите с билиарна атрезия умират в рамките на две години след раждане, освен ако не се извърши операция (процедура по Касай) 5. Впоследствие тези пациенти се нуждаят от задълбочено клинично лечение и често чернодробна трансплантация 6. Предложени са много теории за билиарната атрезия етиопатогенеза, като вирусна инфекция, вроден дефект, автоимунно заболяване и токсичен обида. Приносът на всеки от тях за развитието на билиарна атрезия остава неубедителен 7,8,9,10.
За разлика от кърмачетата, които страдат от патологична атрезия на жлъчните пътища, морската минога претърпява програмирано развитие на атрезия на жлъчните пътища без продължително некроинфламация, фиброза или цироза 10. Животните могат да получат преходна холестаза по време на този процес 10, но се адаптират към това състояние. Развитие чрез синтез de novo и секреция на жлъчни соли в червата след развитие на билиарна атрезия, в допълнение към известните механизми като намален синтез на жлъчни соли в черния дроб 11. Този процес на развитие в голямата морска минога предоставя единствената известна възможност за изследване на прогресията на билиарната атрезия.
Новоразработен метод, наречен "яснота", позволява изображения с висока разделителна способност в сложни нервни системи на бозайници чрез трансформиране на непокътната тъкан в оптично прозрачен нанопорест хидрогел 12. Използвайки черен дроб на морска минога и модифициран протокол CLARITY, изобразяването на тъканна интактна билиарна дегенерация може да бъде документирано в целия черен дроб метаморфоза.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
А. Подготвителен разтвор
2. Подготовка на тъканите
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
Няколко важни събития се случват в развитието на хепатобилиарната система по време на метаморфозата на морската минога. Жлъчните пътища и жлъчния мехур и претърпяват дегенеративна апоптоза (Фигура 1). Комбинацията от метода на модифицираното избистряне и маркера за оцветяване на черния дроб на клетките на цитокератин 19 (CK19, присъстващ както в холангиоцитите, така и в хепатоцитите преди и след 13 метаморфоза) и антиапоптотичния маркер Bcl2 с помощта на конфокална микроскопия, наборът от жлъчната система е уловен заедно оста Z ( фигура 2) и триизмерната структура беше реконструирана (фигура 3). Конфокалната лазерна сканираща микроскопия се използва за извършване на оптичната секция през непокътнатия черен дроб, тъй като по-голямата част от жлъчната система е вградена в черния дроб, с изключение на кръстовището, където жлъчният канал навлиза в червата. Дегенеративният процес протича в метаморфни етапи 2-4, от периферни малки жлъчни пътища до големия централен интрахеп системен общ жлъчен канал (фигура 2), в съответствие с предишни проучвания 10.