Модел на хиперандрогенна мишка за изследване на протокол за синдром на поликистозен яйчник (преведен на немски)

Обобщение

Ние описваме развитието на постно PCOS-подобен модел на мишка, използващ пелетен дихидротестостерон за изследване на патофизиологията на PCOS и потомството от тези PCOS-подобни язовири.

Резюме

Хиперандрогенемията играе решаваща роля за репродуктивната и метаболитната функция при жените и е отличителен белег на синдрома на поликистозните яйчници. Разработването на тънък модел, подобен на PCOS, който имитира жени с PCOS е от клинично значение. В този протокол описваме такъв модел. Чрез вмъкване на дължина на DHT (дихидротестостерон) кристални прахообразни пелети 4 mm (общата дължина на пелетите е 8 mm) и замяната му ежемесечно, можем да използваме PCOS-подобен модел на мишка със серумно ниво на DHT 2 пъти по-високо от мишки, които не са имплантирани с За производство на DHT (не-DHT). Наблюдавахме репродуктивна и метаболитна дисфункция, без да променяме теглото или телесния състав. Въпреки че показват високи нива на безплодие, малка част от тези PCOS-подобни женски мишки могат да забременеят и техните потомци показват забавен пубертет и повишени нива на тестостерон като възрастни. Този подобен на PCOS модел на тънка мишка е полезен инструмент за изучаване на патофизиологията на PCOS и на потомството от тези язовири, подобни на PCOS.

Въведение

Тази нова парадигма (NIH и AE-PCOS обществени критерии) моделира заболяването, като произвежда относително сходни нива на андрогени с тези на жените с PCOS 2-3 пъти по-високи нива на тестостерон или DHT в сравнение с незасегнатите жени. Този модел обаче се поддържа от постоянен екзогенен DHT, а не от програмиран ендогенен хиперандрогенизъм, след като DHT бъде оттеглен. Общата цел на тази статия е да се съсредоточи върху 1) как да пелетираме DHT; (2) как да се генерира Lean PCOS като модел на мишката; (3) Стратегии за оценка на женското потомство от тези язовири. Други измервания и оценка на фенотипите не са обхванати в този ръкопис, но могат да бъдат намерени в 5, 15, 23, 24, 25, 26.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Тук представяме подробни протоколи за подготовка и включване на DHT пелети "и" за репродуктивни и метаболитни тестове. Мишките, използвани в това проучване, са със смесен произход (C57/B6, CD1, 129Sv) и са обгрижвани с храна и вода ad libitum в 14/10 h светло-тъмен цикъл при 24 ° C в Бродуей Изследователска сграда за животински съоръжения в Медицинския факултет на университета Джон Хопкинс. Всички процедури бяха одобрени от Комитета за грижа и употреба на животните в Университета Джон Хопкинс.

1. Създайте PCOS-подобен модел на мишката

2. Оценете репродуктивните профили на женското потомство от хронично DHT вложени язовири

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Серумно ниво на DHT и тест за толерантност към глюкоза

Нивата на DHT се измерват от събрания серум както от ELISA, така и от LC-MS, като се използват протоколи 1.24-1.25 и 2.9, 3.0. Абсолютните стойности на DHT се различават между масовата спектрометрия и ELISA, но относителната гънка на DHT спрямо не-DHT вложка е подобна и от двата анализа и при експерименти 15, 23, 24 ((приблизително 2-кратна) Фигура 2А). Нивата на DHT са значително увеличени при DHT и без DHT мишки поради предразсъдъци поради бременност, но нивата на DHT са два пъти по-високи при DHT мишки в сравнение с мишки без DHT и в двете прегестационни (един ден преди чифтосването) ) и гестационна възраст (около 14 дни) пъти (фиг. 2 б). Тъй като ELISA и LC-MS диференцират абсолютните нива на DHT, ние изчисляваме относителни нива (промяна в пъти: DHT ниво с вмъкване на DHT срещу вмъкване без DHT) в тестовете. Женски мишки с DHT показват нарушен глюкозен толеранс в сравнение с no-DHT 2 седмици след въвеждането на DHT съгласно протокол 1.23 (Фигура 3).

Телесно тегло и пубертет на женското поколение

Въпреки че обикновено са стерилни, някои язовири са бременни и имат кученца (около 30% от бременността, така че получаваме язовири за плодовитост от 10 теста, обикновено 3 бременни язовири, вижте Протокол 2.1). Следователно можем да оценим хроничните андрогенни ефекти върху майките върху женското потомство. Женските потомци на DHT вмъкнати язовири се наричат ​​DHT дъщери, а тези на DHT вмъкнати язовири не са DHT дъщери. Не наблюдавахме разлика между дъщерите без DHT и DHT за възрастта на влагалищния отвор. Въпреки това, първият еструс за дъщери с DHT е значително забавен (ден 35 за дъщеря без DHT; ден 42 за дъщеря с DHT). Това е свързано с намалено телесно тегло при 35 и 42 PND при дъщери с DHT в сравнение с дъщери без DHT (Фигура 4; вижте протокол 2.4 - 2.7).

Нива на хормони и естрозна цикличност при женското потомство

Нивата на тестостерон не се променят в 21 PND, но се намаляват в 26 PND. Тестостеронът обаче се повишава при 70 PND (Фигура 5, вижте протокол 2.9-3.0). Възрастните DHT дъщери показват нарушена естрозна цикличност в сравнение с възрастните дъщери без DHT, значително по-дълги пъти m/d и по-малко време в P и E (Фиг. 6А, Б.; според метода в протокола 1.17 - 1.22).

изследване
Фигура 1: Идентификация на мишката. В клетката на мишката ухото е показано набито на друга позиция на номера на мишката. Мишка №1 до 3 е подпечатана на дясното ухо, а №4 до 6 - на лявото ухо, когато се гледа дорзално. Ако мишката бъде ударена в ушите на # 1 и # 4 място, това е # 7; на 2 и 5 е # 8; на 3 и 6 е # 9; в средата на лявото ухо е # 10; в позиция 1 до 10 е # 11; и т.н. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

модел
Фигура 2: Серумни нива на DHT. Нива на DHT в серума. (А.) Серумните нива на DHT могат да бъдат измерени чрез ELISA и масспектрометрия. Въпреки че абсолютните стойности са различни, двукратните анализи показват сходни разлики между DHT и не-DHT третирани мишки. (Б.) Промяна на серумната DHT гънка в сравнение с нивата, които не са DHT в предварителни и гестационни моменти от време. No-DHT (отворени решетки) и DHT, имплантирани (черни решетки) при женски мишки преди (един ден преди чифтосването) и по време на бременност (около 14 дни от бременността). Стойностите са средни ± S.E.M. N = 5-8 на група. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

изследване
Фигура 3: Тест за толерантност към глюкоза (GTT). Имплантираните мишки без DHT и DHT бяха на гладно през нощта и глюкозата (2 g/kg BW) се инжектира интраперитонеално и кръвната захар в опашката се измерва в различни часови точки. Третираните с DHT мишки показват значително повишени нива на кръвната захар между 30 до 120 минути в сравнение с не-третирани с DHT мишки. Стойностите са средни ± S.E.M. N = 4-12 на група. * P 2 се промени, моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

модел
Фигура 6: Хроничният излишък на андроген при майката води до нарушена цикличност при възрастни дъщери. (А.) Представяне на естрозната цикличност на женското потомство. (Б.) Процентът на времето, прекарано във всяка естрозна фаза (ос Y) в рамките на 15 дни (ос X), измерено чрез цитологично изследване на вагинални клетки. Стойностите са средни ± S.E.M. N = 5-9 на група. Етапът на естрозния цикъл (оста Y). M/d: изпълнено/Diestrus; Р: Проеструс; Д: Топлина. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

хиперандрогенна
Таблица 1: Кетамин/ксилазин коктейл.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Хиперандрогенизмът е ключова характеристика на СПКЯ. Серумните нива на DHT (две пъти по-високи при DHT мишки, отколкото при мишки без DHT), използвани в този протокол, са по-ниски от тези, съобщени от други изследователи в предишни проучвания и са калибрирани, за да имитират пропорционално жени с PCOS 5, 19, 20, 21. За разлика от други модели, този двукратен DHT модел не променя телесното тегло и състава на цялото тяло в сравнение с мишки без DHT до 3,5 месеца след въвеждането на DHT 23, 24. Тези възрастни мишки, имплантирани с DHT, се поддържат от постоянен екзогенен DHT. Въпреки че съставът на цялото тяло не е променен, промяна в структурата и функцията на адипоцитите е наблюдавана при слаби жени при СПКЯ 20. Гарантира се внимателен преглед на различните складове. Наблюдавахме нарушена естрозна цикличност в рамките на една седмица след въвеждането на DHT 15 и намалена плодовитост по време на тримесечен рейтинг на плодовитост 23.

Малката подгрупа от третирани с DHT женски мишки, които биха могли да заченат и да имат потомство, предоставиха възможност за оценка на ефектите от прегестационната, гестационната и кърмещата хиперандрогенемия върху развитието на плода. За да се получи правилно контролиран експеримент, са необходими множество разплодни кучки, което изисква да бъдат установени поне 10 чифтосващи двойки. DHT дъщерите са изложени на DHT само по време на бременност и преди 21 PNA. DHT дъщерите показват по-ниско телесно тегло в сравнение с дъщерите без DHT, което показва, че затлъстяването или наднорменото тегло не са объркващи променливи в наблюдаваните физиологични ефекти 15 .

В първоначалните проучвания ние потвърдихме серумните нива на DHT с течение на времето. Не открихме значителни разлики в серумния DHT на 1, 2, 3 и 4 седмици 23, 24. Нивата на DHT намаляват след 4 седмици, така че заместваме DHT пелетите на всеки 4 седмици. Не наблюдавахме намалени ефекти на DHT, които също се съхраняват 3 месеца при стайна температура. Важно е да инкубирате пелетите във физиологичен разтвор за 24 часа преди поставянето. Тази стъпка е важна за равномерното освобождаване на DHT от пелетата (DHT се освобождава бавно през силастичните тръби). Естрозната цикличност може да се провери след 3 дни вмъкване на DHT, а вагиналната цитонамазка може да се изследва директно във физиологичен разтвор без химикали и оцветяване под светлинен микроскоп, след като се запознаете с клетките 27 вида.

Метаболитният фенотип може да бъде оценен на или след 2 седмици (14 дни) на въвеждане на DHT. Въпреки това, ефектите на DHT върху метаболизма в края на четвъртата седмица (28 дни) са леко отслабени, въпреки че не се наблюдава затихване на репродуктивната дисфункция. Следователно, ние обикновено оценяваме метаболитната функция в края на 2, 3, 5, 6, 7 седмици (вмъкнете 14, общо 21, 35, 42 и 49 дни 2 пъти). Лабораторното производство на стероидни пелети с бавно освобождаване е зряла техника, която е широко възприета от различни лаборатории 33,34. Представлява евтина алтернатива на търговски продукти, които са над $ 50/пелет (90 дневни DHT пелети от, 5 mg/пелета, IRA, NA-161) Търговският продукт има предимството, че не се нуждае от подмяна до 90 дни, докато описаните в този доклад пелети трябва да се подменят на всеки 28 дни. За мащабни проучвания изследователите могат да намерят за по-икономично да произвеждат собствени пелети, дори с допълнителна работа, необходима за подмяна на пелети на всеки 4 седмици.

Както се наблюдава от други, моделите с хронична имплантация на DHT след раждането не показват повишена честота на пулсиране на LH и това може да показва различни патологични механизми на повишена андроген-индуцирана репродуктивна функция между развитието и късно придобития хиперандрогенизъм. С този протокол можем да изследваме женско потомство от хронично хиперандрогенни язовири. Можем да използваме този модел, за да се опитаме да разберем репродуктивните (напр. Развитието на фоликулите, овулацията (Corpora Lutea) и плодовитостта) и метаболитните последици (напр. Глюкозен или липиден метаболизъм, телесен състав, мастно депо. (Разпределение). Нашият протокол добавя нов инструмент за изследване на повишени андрогенни репродуктивни и метаболитни нарушения и отдалечава патофизиологията, причинена от повишен андроген, от тези, които могат да се дължат на затлъстяване. Този модел може да се използва за изследване на специфичните за тъканите ефекти на повишените андрогени при жените В допълнение, методологията, докладвана тук за производство на DHT пелети, може лесно да се приложи при изследването на другите стероидни хормони.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.