Митохондриални цитопатии - PDF безплатно изтегляне

Митохондриални цитопатии Обработка на различната патогенеза на избрани митохондриални цитопатии, използвайки две казуси от Christian Haverkamp

митохондриални

Митохондриални цитопатии Обработка на различната патогенеза на избрани митохондриални цитопатии въз основа на две казуси Дисертация, одобрена от Медицинския факултет на Рейнската-Вестфалиска техническа школа в Аахен за придобиване на академична степен на доктор по медицина, представена от Ларс Кристиан Арндт Симон Хаверкамп от професор д-р Дюсбург обратно нат. Герхард Бусе г-н университетски професор д-р мед. J. Michael Schröder Устен изпитен ден: 13 юни 2008 г. Тази дисертация е достъпна онлайн на уебсайта на университетската библиотека

Съдържание 1 Въведение. 4 1.1 Митохондрии. 4 1.1.1 Окислително фосфорилиране (OXPHOS). 4 1.1.2 Реактивни видове кислород. 5 1.1.3 Апоптоза. 5 1.2 Структура и организация на митохондриалната ДНК (mtdna). 6 1.3 Първични митохондропатии. 8 1.3.1 Точкови мутации на mtdna. 8 1.3.2 Изтривания на mtdna. 11 1.4 Вторични митохондропатии. 11 1.5 Първична кардиомиопатия. 12 1.5.1 Ядрени генни дефекти. 12 1.5.2 Митохондриални генни дефекти. 15 2 Цел на работата. 19 3 Материал и методи. 20 3.1 Произход на тъканните проби. 20 3.1.1 Контроли. 20 3.1.2 Пациент p1/p2. 20 3.1.3 Пациент p3. 21 3.1.4 Пациент p4. 21 3.2 Подготовка на митохондриална ДНК. 25 3.2.1 Изолиране на mtdna от кръв. 25 3.2.2 Изолиране на mtdna от мускулната тъкан. 26 3.2.3 Органичен лизис. 27 3.2.4 Екстракция с фенол/хлороформ. 27 3.3 Гел електрофореза. 27

3.3.1 Електрофореза в агарозен гел. 27 3.3.2 Електрофореза в акриламиден гел. 28 3.4 PCR. 30 3.4.1 Конвенционална PCR. 30 3.4.2 -PCR (LPCR) на дълги разстояния. 32 3.5 Последователност. 33 3.5.1 Пречистване на ДНК. 34 3.5.2 Реакция на секвениране. 34 3.5.3 Подготовка на пробите за автоматично измерване. 34 3.5.4 Оценка на измерването. 35 3.6 Полиморфизъм на дължина на фрагмент с ограничение (RFLP). 35 3.6.1 MERRF: Ban-II A8344G. 35 3.6.2 МЕЛАС: Apa-1 A3243G. 35 3.6.3 LEIGH: Msp-I T8993C/G. 36 3.6.4 LHON: SfaN-I 11778A/Mae-III 11778A. 36 3.7 Решения и буфери. 37 4 резултата. 40 4.1 LHON. 40 4.1.1 Подготовка. 40 4.1.2 PCR. 40 4.1.3 Анализ на ограничението. 40 4.2 Кардиомиопатии. 4.2.1 Подготовка на микромускулите. 42 4.2.2 Подготовка. 43 4.2.3 Проверка за изтриване на LPCR. 43 4.2.4 Последователност. 45 5 Дискусия. 47 5.1 LHON. 47

5.1.1 Патогенеза. 47 5.1.2 Цитостатична терапия. 51 5.1.3 Литература и окончателна оценка. 54 5.2 Кардиомиопатия. 56 5.2.1 Междугеномна комуникация. 56 5.2.2 Значимост на констатираните промени. 65 5.2.3 Резюме. 67 6 Справочници. 69 6.1 Списък на таблици. 69 6.2 Списък на фигурите. 69 6.3 Списък на съкращенията. 70 6.4 Библиография. 73

1.1 Митохондрии Хроматиновата кондензация и разграждането на хроматина, в които участва и CAD. Отварянето на митохондриалната пропусклива пора за пропускливост (mtptp) изглежда води до колапс на електрохимичния градиент, до подуване на вътрешната мембрана и до разкъсване на външната мембрана. Изглежда, че mtptp се състои от андрозин нуклеотиден транслокатор (ANT), порин и други фактори като Bax (свързан с BCL2 X протеин), Bcl2 (b-клетъчна левкемия/лимфом 2), циклофилин D и бензодиазепиновия рецептор. Откриването вероятно е причинено от повишена експозиция на ROS, спад в Ψ или прекомерен прием на калций.2–9 Фигура 1: Важни метаболитни пътища в митохондрията 1.2 Структура и организация на митохондриалната ДНК (mtdna) Митохондриите са под контрола на два генома. По-голямата част от митохондриалните структурни и функционални протеини са кодирани от ядрото, преведени в цитозола и транспортирани в митохондрията чрез последователност за разпознаване. 13 протеинови субединици, 22 trnas и 2 rrnas са кодирани от митохондриален геном. Протеините са изключително част от дихателната верига: цитохром b, субединици 1, 2 и 3 на цитохром с оксидаза, 6-та

1.2 Структура и организация на митохондриалната ДНК (mtdna) Фигура 2: Митохондриален геном и характерни мутации 1.3 Първични митохондропатии 1.3.1 Точкови мутации на mtdna 1.3.1.1 Наследствената оптична невропатия на Лебер (LHON) LHON води остро до подостра до слепота чрез централна загуба на зрителното поле. Засяга предимно мъжете на средна възраст. Понастоящем има 18 известни мутации в митохондриална ДНК, които причиняват заболяването самостоятелно или в комбинация. 1.3.1.1.1 Клинични характеристики Симптомите обикновено започват в средна възраст с остра до подостра безболезнена загуба на централното зрително поле. Фундоскопски, 8

3,6 g тъкан, която се разделя на порции от приблизително 100 mg. След това тази част се третира като микропрепарат 26, индивида

3.2 Подготовка на митохондриална ДНК Гранулите на митохондриите се събират. Максималната подготовка се използва за получаване на контролни шаблони. Материалът на пациента е от порядъка на

3.4 PCR праймери и реверсивни праймери (MWG Biotech) и 1350 µl Aqua стерилни. Условията за PCR за отделните фрагменти са изброени в таблица 5 и таблица 6. Условията за PCR се различават за съответните фрагменти по отношение на температурата на отгряване, времето за удължаване и броя на циклите. Температура в Целзий Време в секунди Първа денатурация 94 300 Денатурация 94 30 Отгряване Tann 60 Удължаване 72 Текстова таблица 5: Основен PCR профил 31

3.6 Полиморфизъм на дължина на рестрикционен фрагмент (RFLP) 3.6.3 LEIGH: Msp-I T8993C/G Мутацията на LEIGH T8993C и T8993G се открива чрез RFLP анализ на фрагмент 7. Рестрикционният модел на Msp-I (Gibco BRL) с мястото на разцепване C ^ CGG за този фрагмент е показан на ФИГ. MELAS: A3243G див тип MERRF: A8344G мутация див тип 3001 Leigh: T8993C/G мутация див тип 7415 мутация 8363 246bp 3247 1431bp 839bp 839bp 629/630bp 842bp 1185bp 41bp 8254 41b 8p 9205 Фигура 3: Схематично представяне на рестрикционния модел 3.6.4 LHON: SfaN-I 11778A/Mae-III 11778A Налични са два различни теста за RFLP анализ на LHON мутация 11778. Мутацията на LHON води до елиминиране на едно място на разцепване в рестрикцията на F10 със SfaN-I и ново място на разцепване в случай на ограничение Mae III. Използването на двата метода за изпитване намалява риска от фалшиво отрицателен или фалшиво положителен резултат. 36

3.6 Полиморфизъм на дължина на рестрикционен фрагмент (RFLP) SfaN I: GATGC 11450 997 122 12570 122 12570 LHON 11450 318 679 Див тип Фигура 4: Ограничителен модел LHON 11778 с ограничение SfaN I Mae III: 11450 200 ^ GTNAC 125 130 58 607 12570 60750 12570 LHON 255 58 Wild type Фигура 5: Ограничителен модел LHON 11778 с MAE III 3.7 разтвори и буфер Фрагмент-специфичен главен микс (PCR) 5.55% праймер (8 pmol/100 µl) 5.55% обратен праймер (8 pmol/100 µl) 1.11% полимеризация -Смесете 11,11% 10-кратен буфер Taq 76,66% Aqua стерилен буфер за хемолиза 37

3.7 Разтвори и буфери 10 mm NH4HCO3 144 mm NH4Cl Н буфер 210 mm манитол 70 mm захароза 1 mm EDTA 5 mm HEPES (1M разтвор) 0,5% буфер за зареждане с албумин (агарозни гелове) 15% Ficoll 50 mm EDTA 0,5% SDS 1x TBE 0,1% (w/w) бромофенол синьо 0,1% (w/w) буфер за зареждане на ксилол цианол (полиакриламидни гелове) 98% дейонизиран формамид 10 mm EDTA, pH 8,0 0,025% бромофенол синьо 0,025% ксилен цианол захароза буфер 250 mm захароза 38

3.7 Разтвори и буфери 10 mm TrisCl ph 7.4 1 mm EDTA SDS разтвор (0.1%) 0.1% SDS 1 mm EDTA 10xTBE ​​1M Tris-HCl 0.83 M борна киселина 10 mm EDTA, коригирано до рН 8.3 TE буфер 10 mm TrisCl, pH 8,0 1 mm EDTA 39

4.1 LHON Това ново място на разцепване е причинено от LHON мутация в позиция 11778. Няма остатъци от дивия тип (255 bp). L K p1 L 607 bp 255 bp 200 bp 125 bp и 130 bp Фигура 6: Агарозен гел за отделяне на рестрикционните фрагменти Mae III Майката на пациент p2 също носи мутацията хомоплазматична в двата клетъчни реда. Фигура 7 показва усвояването на фрагмент 10 (левкоцитен препарат) с рестрикционния ензим SfaN1. Контролата (K) показва 3 ленти (679 bp, 318 bp и 122 bp). В изследвания фрагмент 10 (р2) е пропуснато едно място на разцепване в позиция 11778; отсъстват 679 bp и 318 bp ленти. Вместо това възниква лента от 997 bp. Този резултат е в съответствие с храносмилането с Mae-III, не е показано тук. 41