Mir-146a-5p инхибира активирането и пролиферацията на чернодробни звездни клетки в

Теми
Резюме
Въведение
Резултати
Диференциална експресия на чернодробни miRNAs при мишки с фиброзиращ стеатохепатит
Анализ на генната онтология и анализ на пътищата на ДНК микрочипове за диференциално експресирани miRNAs
Валидиране на експресията на miRNA чрез количествена PCR в реално време (qRT-PCR)
miR-146a-5p е понижен в HSC активиран инвитро
Свръхекспресията на miR-146a-5p инхибира пролиферацията на HSC
Ефекти на miR-146a-4p върху HSC активиране и отлагане на колаген
miR-146a-5p действа директно върху 3'UTRs на Wnt1 и Wnt5a иРНК
miR-146a-5p Wnt1 и Wnt5a регулирани надолу на ниво след транскрипция
Ефекти от свръхекспресията и инхибирането на miR-146a-5p върху целеви гени след потока от сигналния път Wnt
Нокдаунът Wnt1 или Wnt5a инхибира генните експресии на сигнализация и фиброгенеза след Wnt
Дискусия
Методите
Животински модели на безалкохолен фиброзиращ стеатохепатит
Хистологичен анализ и биохимичен анализ
Изследване на микрочипове
QRT-PCR анализ
Идентифициране на потенциални цели на гена miRNA
Изолиране, култивиране и идентифициране на HSC
miR-146a-5p трансфекция в HSC
РНК интерференция и трансфекция
Имуноцитохимичен анализ
Тест за клетъчна пролиферация
Western blot анализ
Анализ на активността на луциферазата
статистически анализи
Допълнителна информация
Допълнителна информация
PDF файлове
Допълнителна информация
коментари

Теми

Чернодробна фиброза
Безалкохолна мастна чернодробна болест

Резюме

Въведение

Безалкохолният стеатохепатит (NASH) е част от спектъра на мастната безалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD), характеризираща се със стеатоза, лобуларно възпаление и прогресивна перицелуларна фиброза 1. При продължително чернодробно увреждане стеатохепатитът може да прогресира до чернодробна фиброза, свързана с прекомерно натрупване на извънклетъчен матрикс (ECM). Чернодробните звездни клетки (HSC) играят централна роля в патогенезата на чернодробната фиброза 2. HSC в покой може да бъде активиран в отговор на хроничен стеатохепатит 3. Активираните HSC стимулират производството на колаген и натрупването на ECM, което води до развитие на чернодробна фиброза 4. Въпреки фундаменталния напредък в разбирането на патофизиологията на фиброзиращия стеатохепатит без алкохол, механизмите на фиброгенезата в присъствието на стеатохепатит остават неуловими.

Резултати

Диференциална експресия на чернодробни miRNAs при мишки с фиброзиращ стеатохепатит

Както е показано на фигура 1, чернодробните участъци на мишки, хранени с диета с MCD, показват нарушена структура на лобулите, макростеатоза в зона 3, локализирана или фокална хепатоцитна некроза, възпалителна инфилтрация и перисинусоидална фиброза (фиг. 1А). серум. и нива на AST (P 2 пъти) (Фиг. 1C).

( AT ) Хистопатологични промени в чернодробни секции при мишки, хранени с MCD диета и оцветения контрол на хематоксилин и еозин (отгоре) и трихроматизъм на Masson (отдолу). ( Б. ) Ефект на MCD диетата върху серумните нива на ALT и AST. ( СРЕЩУ ) Различно регулирани miRNAs, идентифицирани от miRNA microarray. ( д ) Проверка на данните от ДНК микрочипове с помощта на RT-PCR в реално време. Бяха извършени трикратни анализи за всяка РНК проба и относителното количество на всяка miRNA беше нормализирано до U6 snRNA. Стойностите са средни ± SD, ** P

( AT ) Анализ на GO категория, базиран на прогнозирани цели на всички диференцирано регулирани miRNAs. Вертикалната ос представлява категорията GO, а хоризонталната ос обогатяването на GO. ( Б. ) Анализ на пътя за диференциално регулирани miRNAs. От всяка мишка се събират само платна с P 6 CSH. Чистотата на прясно изолираните живи HSCs беше определена да бъде по-голяма от 95% чрез метода за изключване на трипан синьо. Имунофлуоресцентното оцветяване на α-SMA, маркер за HSC активиране, показва значително увеличение на първично активираните HSC in vitro (Фигура 3А). Показано е, че експресията на miR-146a-5p е силно регулирана надолу в активирани HSC (Фигура 3В).

( AT ) Представителни морфологични изображения и имуноцитохимично оцветяване на активирани и почиващи HSC за десмин и α-SMA (400 ×). Изразът на ( Б. ) miR-146a-5p беше изследван чрез qRT-PCR в реално време. Стойностите са средни ± SD, ** P # P

( AT ) Оцветяването с Desmin, което показва LX-2 и HSC-T6 клетъчна пролиферация намалява, когато miR-146a-5p е свръхекспресиран. The ( Б. ) miR-146a-5p инхибира растежа на LX-2 и HSC-T6 клетки, както се определя от CCK-8 анализи. Стойностите са средни ± SD, * P

( AT, СРЕЩУ ) потенциални сайтове за свързване на miR-146a-5p на 3'UTRs на Wnt1 и Wnt5a. ( Б., д ) HEK-293T клетките бяха трансфектирани с луциферазен репортерен вектор, съдържащ див тип или мутантна форма на 3′UTR на Wnt1 и Wnt5a, в присъствието на miR-146a-5p имитира, имитиращ контрол, на miR-146a. -5p инхибитор и инхибиторен контрол, след което се оценява за активността на репортер на луцифераза на 48 часа след трансфекцията. Стойностите са средни ± стандартно отклонение, * P # P # P ## P

( AT ) нива на иРНК и протеини ( Б. ) β-катенин, GSK-3β и NFAT5 при мишки, хранени с черен дроб с MCD диета и в контроли. ( СРЕЩУ ) HSC-T6 бяха трансфектирани с инхибитор на miR-146a-5p или инхибитор, имитира miR-146a-5p или миметичен контрол за 48 h. Нивата на иРНК и протеини ( д ) β-катенин, GSK-3β и NFAT5 са анализирани съответно с RT-PCR в реално време и Western blot. За контрол на натоварването се използва control-актин. Стойностите са средни ± SD, ** P

В заключение идентифицирахме чернодробните miRNAs и оценихме профилите на тяхната експресия при безалкохолен фиброзиращ стеатохепатит, индуциран от MCD диетата, използвайки микрочипа. Сред валидираните miRNAs, miR-146a-5p беше силно понижен при безалкохолен фиброзиращ стеатохепатит и при активирани HSC. Свръхекспресията на miR-146a-5p допринесе за развитието на чернодробна фиброза чрез инхибиране на пролиферацията, активиране на HSC и депозиране на колаген, потискайки Wnt сигналния път. Следователно, miR-146a-5p може да служи като нов регулатор в патогенезата на безалкохолния фиброзиращ стеатохепатит.