Микрометастази в сентинелни лимфни възли при рак на стомаха - British Cancer Journal
Резюме
Основна
материали и методи
Хирургични проби и приготвяне на кръв
Таблица в пълен размер
Общо 11 представителни лимфни възли, съдържащи метастази на рак на стомаха и MKN-45, клетъчна линия на рак на стомаха, послужиха като положителни контроли, а лимфните възли от петима пациенти, подложени на операция за неракови заболявания, като контроли. Освен това, 10 ml кръв се събират в епруветки, съдържащи натриев цитрат и се центрофугират с хипотоничен разтвор с градиент на плътността, след което се събират ядрени клетки в кръвта. След това тези лимфоцити от периферна кръв от пет здрави донори бяха използвани като допълнителна отрицателна контрола.
RT-PCR и Southern blot тест
Имунооцветяване
Всички проби бяха фиксирани в 10% формалин, вградени в парафин и нарязани на 4 μm серийни секции. Пробите бяха имунооцветени за СК-18, използвайки метода на авидин-биотин-пероксидаза. След депарафинизиране срезовете се обработват с 0,3% водороден пероксид в метанол в продължение на 30 минути, за да се блокира ендогенната пероксидаза и се промиват с фосфатен буферен разтвор. След това пробите бяха инкубирани с нормален кози серум в продължение на 30 минути за отстраняване на неспецифичното оцветяване и реагираха в продължение на една нощ при 4 ° С с анти-СК-18 моноклонално антитяло, разредено 1: 100. Козя анти-заешка и анти-мишка пероксидаза белязан (белязан полимерен реагент) имуноглобулин (Dakopatts) се прилага за 60 минути като вторични антитела. Накрая, диаминобензидин беше добавен за оцветяване и метилово зелено беше използвано за ядрено оцветяване. За отрицателната контрола вместо първичното антитяло се използва нормален заешки IgG.
Микрометастаза
В това проучване микрометастазата се дефинира като метастази, открити само чрез RT-PCR и Southern blot анализ или имунооцветяване.
Резултати
Експресия на иРНК на туморен маркер в контролите
Нито един от четирите иРНК маркери, CK-18, CEA, hTRT или MUC-1, не се експресира в нито един от отрицателните контроли, а именно лимфоцити от пет здрави донори и пет лимфни възли от пациенти без рак. CK-18 се изразява в осем (73%) от единадесет лимфни възли, съдържащи метастази на рак на стомаха, CEA в седем (64%), hTRT в шест (55%) и MUC-1 в шест (55%). С други думи, поне един тРНК маркер се експресира във всички положителни контроли. CK-18 и CEA успяха да открият MKN-45 клетка в 106 лимфоцити, 10 hTRT клетки и 100 MUC-1100 клетки (Фигура 1).
Чувствителност на RT-PCR и Southern blot анализ на иРНК маркери за рак на стомаха. В 106 лимфоцити една клетка от клетъчна линия на стомашния рак MKN-45 може да бъде открита чрез CK-18 и CEA, 10 клетки могат да бъдат открити чрез hTRT и 100 клетки могат да бъдат открити чрез MUC-1.