Метод за патоморфологично определяне на продължителността на началото на миокарден инфаркт
Притежатели на патента RU 2518333:
Изобретението се отнася до областта на медицината. За патоморфологично определяне на продължителността на инфаркта на миокарда, тъканна проба се фиксира и вгражда в парафин. Получават се срезове, обезводняват се и се загряват, измиват се в буферен разтвор, инкубират се във влажна камера с реагент и се обработват с проявяващ агент, дехидратират се и се затварят в среда. Като реагент се използват антитела към матричната металопротеаза 9 в разреждане 1: 100-1: 250. Срезите се инкубират с реагента при 25 ° С и 100% относителна влажност в продължение на 60 минути. При микроскопско откриване при приготвянето на ярко оцветени неутрофили в съдовете на перифарктната зона и ярко оцветени неутрофили в зоната на инфаркта, възрастта на инфаркта се установява от 2 часа до 1 ден. При откриване на дегранулация на неутрофили и ярък цвят на извънклетъчния матрикс в зоната на инфаркта - от 1 до 2 дни. Когато се открият оцветени клетки от фибробластичния ред в граничната зона на инфаркта - от 3 до 30 дни. Методът позволява да се разграничи периодът на ограничаване на настъпването на миокарден инфаркт от 2 часа до 30 дни. 3 dwg., 1 пр.
Предложеното изобретение се отнася до областта на медицината, а именно до патологичната анатомия.
Известно е, че точното установяване на давностния срок на инфаркта на миокарда е от голямо значение за патолога.
Известен метод за макроскопска диагностика на ранни срокове на миокарден инфаркт, основан на взаимодействието на калиев телурит с тъканни дехидрогенази. Извън зоната на инфаркта калиев телурит оцветява миокарда в сиво или черно, докато зоната на некроза остава неоцветена поради разрушаването на тези ензими в зоната на инфаркта на миокарда (Палцев М.А., Аничков Н.М. Патологична анатомия. В 2 т., Том 2, Част 1. - М.: Медицина, 2001. - С.82).
Недостатъкът на този метод е липсата на възможност за диференцирано определяне на настъпването на миокарден инфаркт. Известният метод позволява да се идентифицира само некротичният стадий на миокарден инфаркт (период от 2 часа до 3 дни), тъй като след началото на етапа на организация, активността на дехидрогеназите в тъканта постепенно се възстановява.
В допълнение, използването на този метод затруднява получаването на висококачествени проби за хистологични и имунохистологични изследвания и намалява качеството на документиране на морфологичните промени в миокарда поради факта, че боите упорито оцветяват тъканта в сив цвят. При по-нататъшно задължително проучване на материала, този цвят пречи на оцветяването със стандартни багрила.
Известният метод се провежда, както следва. Фрагменти от сърдечния мускул се фиксират с 15% воден неутрален разтвор на формалин за 24 часа при стайна температура. Впоследствие материалът се подлага на влагане на парафин, след което се приготвят хистологични срезове, които се обезпаразитяват чрез обработка на три порции о-ксилол и последващо нагряване в термостат при 37 ° С в продължение на 3 часа. Дехидратацията на секциите се постига чрез 3-минутна обработка във всяка от четирите порции етанол (абсолютна, 96% 70% и 56%). След това срезовете се прехвърлят за 5 минути в 0,05 М буфериран физиологичен разтвор с рН 7,6. Блокирането на ендогенната пероксидаза се извършва с пресен разтвор на 3% водороден пероксид в продължение на 10 минути, промива се с буфериран физиологичен разтвор за 5 минути. След това срезите се държат под капка от 5% разтвор на конски серумен албумин. След това излишният албумин се изтръсква и предметите се избърсват внимателно около секциите. Капка от афинитетно пречистени заешки първични антитела срещу свързания с бременността алфа-гликопротеин в концентрация от 8 μg/ml се прилага върху последния. Секциите се инкубират за 30 минути при 37 ° С във влажна камера, след което се промиват два пъти с буфериран физиологичен разтвор. Хистологичните срези се инкубират във вторични биотинилирани антитела при разреждане от 10 μg на 1 ml буфериран физиологичен разтвор в продължение на 30 минути, след което се промиват с буфериран физиологичен разтвор за 5 минути. След това срезовете се обработват с авидин-пероксидазен комплекс в продължение на 30 минути и се промиват с буфериран физиологичен разтвор. Имунологичната проява се извършва в 0,03% разтвор на субстрат на базата на диаминобензидин (DAB хромоген) в продължение на 10 минути. Реакцията се спира чрез изплакване на секциите в две порции дестилирана вода. Клетъчните ядра се оцветяват с хематоксилин за 3 минути. Освен това разрезите се извършват през пресни алкохоли с възходяща концентрация (56% 70% 96%, абсолютен етанол) и три порции о-ксилол, след което се затварят в балсам.
При изследването на готови микропрепарати се забелязва ясно оцветяване на огнища на исхемична некроза на сърдечния мускул в зоната на миокарден инфаркт. Фокусът на некрозата е кафяв, а останалите тъкани са жълто-сиви.
Недостатъкът на този метод, както и на подобен, е липсата на възможност за точно определяне на давностния срок на инфаркта на миокарда, тъй като методът прототип позволява да се идентифицира само неговият некротичен стадий.
Недостатъците на този метод включват факта, че полуживотът на комплекси, свързани с бременността алфа2-гликопротеин с протеинази, не надвишава 2 минути. Следователно, в рамките на половин час, почти всички ензимни комплекси с свързания с бременността алфа2-гликопротеин достигат до целевите органи, по-специално до черния дроб, където се метаболизират. Извън кръвоносните съдове това разпределение има различни характеристики, тъй като високото молекулно тегло на комплексите предотвратява навлизането им в кръвоносните съдове (Zorin NA ALFA-2-GLYCOPROTEIN, свързано с бременността. НОВИНИ "Vector-Best", N 9, септември, 1998. Цит. Под връзката http://www.vector-best.ru/nvb/st9_5.htm 29.04.12). Следователно откриването на комплекси в граничната зона на миокарден инфаркт е ограничено до много кратък период; идентифицирането на комплекси е възможно само в зоната на некроза, т.е. извън зоните на безопасно кръвоснабдяване.