Локалната пролиферация води до натрупване на макрофаги в мастната тъкан при затлъстяване

субекти

абстрактно

Натрупването на макрофаги в мастната тъкан (ATM) е важна характеристика на свързаното със затлъстяването хронично възпаление. Важно е и при регулирането на развитието на затлъстяването. При слабите животни има малък брой резидентни ATM клетки, разпределени между адипоцитите, считани за M2 макрофаги. В случай на затлъстяване, значително увеличените макрофаги се натрупват в мастната тъкан и образуват т. Нар. "Структура, подобна на короната" (CLS) около мъртвите адипоцити. 1, 2 Тези макрофаги имат M1 фенотип и произвеждат различни видове възпалителни цитокини като TNF- & agr; което води до разпространение на възпаление поради затлъстяване и развитие на метаболитни нарушения като инсулинова резистентност. 3, 4, 5

Традиционно натрупаните банкомати се разглеждат в резултат на миграцията на периферни моноцити при възпалителни състояния. Напоследък все повече доказателства показват, че поддържането на тъканни макрофаги вероятно е независимо от попълването на циркулиращите моноцити и дори независимо от предшествениците на костния мозък. 6 Всъщност различните видове тъканни макрофаги са в състояние да се обновяват и да се възпроизвеждат локално в наивно състояние, като микроглии, 7, 8, Kupffer, 9 и клетки на Лангерханс. В острото възпалително състояние, например по време на паразитна инфекция, се увеличава локалната пролиферация на макрофаги и тези макрофаги проявяват фенотипи на алтернативно активирани макрофаги, процес, който се контролира от Th2 цитокини. 11 При хронични възпалителни състояния като артериосклероза има и локална пролиферация на макрофаги, което допринася за натрупването на макрофаги в артериалните стени. 12 Наскоро беше съобщено, че локалното размножаване на макрофаги може да допринесе за натрупването на затлъстяване в банкомати. 13, 14

Резултати

Натрупването на банкомати в ранните етапи на затлъстяването е свързано с разпространението на макрофаги

мастната

Натрупването на макрофаги в мастната тъкан е свързано с in situ пролиферация в ранните стадии на затлъстяването. ( а ) Телесно тегло на мишки, хранени с ND и HFD (n = 10 мишки във всяка група). Лентите за грешки представляват средни стойности ± SEM *** P + ATM в eAT от мишки на ND или HFD. Мащабна лента, 100 μm

Ранният етап на генетичното затлъстяване е свързан с разпространението на банкомати

Затлъстяването е следствие от сложни взаимодействия между гените и околната среда. В модел на генетично наследено затлъстяване, мишки с дефицит на лептинов рецептор (мишки с проказа db/db, често наричани db/db), изследвахме не само затлъстяването, свързано с диетата, но и дали in situ пролиферацията на макрофаги в АТМ Включва се натрупването. db мишки). Установихме, че натрупването на ATM в мастната тъкан (eAT и iAT) на мишки с проказа db/db в ранните етапи на затлъстяване (на 7 седмици) се увеличава драстично в сравнение с това на техните хетерозиготни котила (2а). Междувременно, Ki67 + макрофагите бяха значително увеличени в мастната тъкан на 7-седмични мишки с проказа db/db (2b). Също така направихме тест за включване на EdU и установихме, че в ранните етапи на генетично затлъстяване (на възраст 10 седмици) са наблюдавани значително повече включени EdU макрофаги в мастната тъкан на мишки с проказа db/db (фигури 2в и г). Процентът на вградените в EdU банкомати от мишки с напреднало генетично затлъстяване (на възраст 30 седмици) също е значително по-висок от този на постните сънародници. По този начин разпространението на макрофаги допринася за натрупването на ATM при генетично затлъстяване.

мастната

пролиферация

За сравнение ние допълнително анализирахме химерното ниво на еозинофилите в мастната тъкан. Еозинофилите са друга подгрупа от миелоидни клетки, за които е доказано, че мигрират от периферната кръв към мастната тъкан и играят важна роля за поддържане на глюкозната хомеостаза, 15 които не се размножават при затлъстели или слаби мишки ). . За разлика от банкоматите, очевидни донорни (CD45.1 +) еозинофили се наблюдават в мастната тъкан на затлъстели мишки както в ранните етапи (8-седмично HFD), така и в късния стадий на затлъстяване (12-седмично HFD) (Фигура 3d)). Поради тази причина потвърдихме, че натрупването на ATM се предизвиква от пролиферация на резидентни макрофаги в ранния стадий на затлъстяването и допълнително се насърчава от миграцията на моноцити в късния стадий на затлъстяването.

Поставихме и интересен въпрос: ограничена ли е силата на макрофагите да се размножават до вътрешни банкомати или може да се наблюдава и при вербувани макрофаги? За да отстраним това, проведохме тест за включване на EdU върху химерни мишки, хранени с HFD, в продължение на 12 седмици. Интересното е, че както CD45.2 +, така и CD45.1 + -Edu-включени банкомати са били открити в мастната тъкан (Фигура 3д), което показва, че макрофагите се размножават независимо от техния произход. По този начин местното размножаване както на резидентни, така и на вербувани макрофаги допринася за натрупването на банкомати.

CCL2 е ненужен за натрупване на макрофаги в ранните стадии на затлъстяването

За да подкрепим заключението, че пролиферацията, а не миграцията на моноцити, играе решаваща роля за натрупването на ATM при ранно затлъстяване, анализирахме локалната експресия на CCL2 (MCP-1) в мастната тъкан, която е централният хемоаттрактант за миграция на моноцити е. Интересното е, че при вътреклетъчно оцветяване открихме, че CCL2 се експресира главно от CD45 - CD31 - стромални клетки в мастната тъкан, а не от CD45 + левкоцити или CD31 + ендотелни клетки. В действителност, в нито една от трите популации от клетки, получени от мастна тъкан на затлъстели мишки, не се наблюдава повишена експресия на CCL2 в сравнение с тази на постни мишки (Фиг. 4а). Следователно нивото на CCL2 в серума не се променя в ранните етапи на затлъстяването (Фигура 4b). На по-късен етап от затлъстяването (HFD> 12 седмици) обаче е установено значително по-високо ниво на CCL2 в серума (Фигура 4в). Тези резултати показват, че CCL2-индуцираната миграция на моноцити не е определяща за натрупването на ATM в ранния стадий на затлъстяването, докато тя може да регулира натрупването на ATM в относително по-късен етап на затлъстяването.

води

макрофаги

Размножаващите се банкомати за предпочитане се намират в CLS. ( а ) Имунофлуоресценция, показваща локализацията на Ki67 + ATM при HFD-индуцирани затлъстели мишки. Стрелките маркират банкоматите извън CLS. Мащабна лента, 100 μm. ( б ) Процент на Ki67 + банкомати в CLS и извън CLS, където 225 ATM са комбинирани от 7 имунофлуоресцентни изображения. *** Р + банкоматите постепенно намаляват заедно с прогресията на затлъстяването. Подробен анализ показа, че експресията на RELM- & agr; в банкоматите Ki67 + е много по-нисък в сравнение с тези в банкоматите Ki67 (допълнителна фигура S2). TNF-? + Банкоматите първо се увеличаваха и след това намаляваха с напредването на затлъстяването. Процентът на Ki67 + TNF- & agr; + ATM е сравним с този на Ki67 - TNF- & agr; + Банкомати (допълнителна фигура S3).

Сигнализацията IL-4/STAT6 е основният двигател за разпространението на банкомати

По-нататък изследвахме митогенните стимули за пролиферация на АТМ. Доказано е, че IL-4, 11 M-CSF, 12 и CCL2 13 могат да контролират локалното разпространение на макрофаги. Когато обаче изследвахме ефектите на тези цитокини върху пролиферацията на АТМ, открихме, че само прилагането на IL-4 може да увеличи пролиферацията на АТМ при слаби мишки. 19 Когато IL-4 се инжектира интраперитонеално в слаби мишки, се наблюдава драстично увеличение на Ki67 + ATM (Фигура 6а). След свързване с неговия рецептор, IL-4 активира JAK1 и JAK3 и след това води до фосфорилиране на STAT6, централен транскрипционен фактор за IL-4-медиирани биологични реакции. 20 Установихме, че индуцираната от IL-4 пролиферация на ATM при мишки с дефицит на STAT6 е сериозно нарушена (Фигура 6а), което предполага критична роля на сигнализирането на IL-4/STAT6 в ATM, управляван от IL-4 - Показва разпространението. По-важното е, че при мишки с HFD процентът на Ki67 + ATM при мишки с дефицит на STAT6 е значително по-нисък, отколкото при WT мишки (6b). По този начин сигнализацията IL-4/STAT6 е движещата сила зад разпространението на банкоматите при затлъстяване.

пролиферация

IL-4/STAT6 управлява разпространението на банкомати. ( а ) Експресия на Ki67 в ATM от eAT на WT и STAT6 -/- мишки, които са били изложени на комплекс от IL-4 и IL-4 антитела (за удължаване на бионаличността на IL-4 in vivo) или PBS за 48 часа са били лекувани. ( б ) Ki67 експресия на WT и STAT6 -/- мишки на HFD в ATM (n = 10 във всяка група). Показани са средните стойности ± SEM

дискусия

Затлъстяването е свързано с натрупването на банкомати, които разпространяват хронично възпаление и насърчават инсулиновата резистентност. Предишни доклади показват, че миграцията на кръвни моноцити допринася за инфилтрацията на макрофаги на възпалените места. 1, 16, 21 Последните данни показват, че местното разпространение също играе роля в регулирането на натрупването на банкомати при затлъстели хора. 13, 14 Въпреки това, съответният принос на тези две събития за натрупването на УВД по време на прогресията на затлъстяването не е разгледан. В това проучване показахме, че пролиферацията in situ на резидентни макрофаги определя натрупването на ATM в ранния стадий на затлъстяването, докато имигрантските моноцити допринасят за натрупването на ATM в относително късен етап на затлъстяването. В допълнение, както резидентните, така и вербуваните макрофаги се размножават в мастната тъкан на затлъстели мишки (обобщено в 7).

макрофаги

Схематично представяне на приноса на пролиферацията на макрофаги и набирането на моноцити за натрупването на ATM при затлъстяване. При слаби мишки пребиваващите макрофаги са в латентно състояние в мастната тъкан и поддържат основно ниво на клетъчност чрез самообновяване. В ранните етапи на затлъстяването тези резидентни макрофаги се размножават и водят до натрупване на АТМ, което се контролира от стимули, които се излъчват от адипоцитите и/или други имунни клетки. В късния стадий на затлъстяване натрупването на АТМ допълнително се увеличава от макрофаги, получени от моноцити, които също имат способността да се размножават. Тези пролифериращи макрофаги винаги се локализират в CLS и обграждат апоптотичните адипоцити. Червените ядра показват, че макрофагите се размножават

По-рано беше съобщено, че периферната моноцитна инфилтрация играе важна роля за натрупването на затлъстяване в банкомати. 1 Като един от основните хемокини при посредничеството при набирането на моноцити се предполага, че CCL2 (MCP-1) медиира натрупването на ATM при затлъстяване. 16 Друг доклад обаче показва, че при липса на CCL2 не се наблюдава намаляване на натрупването на макрофаги в мастната тъкан. 22 Тези противоречиви резултати показват, че миграцията на моноцити не е единственият начин за регулиране на натрупването на макрофаги в мастната тъкан по време на развитието на затлъстяване.

Нашите резултати показват, че резидентните макрофаги се натрупват в мастната тъкан на мишки по време на постната и ранната фаза на затлъстяване. Анализът на фенотипа на банкоматите по време на прогресията на затлъстяването разкрива, че значителен брой алтернативно активирани макрофаги присъстват по време на постната и ранната фаза на затлъстяването. В късния стадий на затлъстяване обаче този тип макрофаги са драстично намалени. Интересното е, че се съобщава, че алтернативно активираните макрофаги увеличават капацитета на липидния катаболизъм. 24, 25, 26 Следователно алтернативно активираните макрофаги в ранните стадии на затлъстяването са основната резидентна популация на макрофаги с по-специализиран липиден катаболизъм от този на имигрантските макрофаги.

В обобщение успяхме да установим, че натрупването на макрофаги в мастната тъкан по време на затлъстяване се предизвиква от in-situ пролиферация на резидентни банкомати и се насърчава допълнително чрез съгласувано активиране на миграцията на моноцити и пролиферацията на макрофаги. Нашите наблюдения дават представа за развитието на възпаление, свързано със затлъстяването, и могат да служат като ръководство за разработване на терапевтични стратегии за разстройства, свързани със затлъстяването.

Материали и методи

Тестване върху животни

C57BL/6 мишки са закупени от Шанхайския лабораторен център за животни към Китайската академия на науките (Шанхай, Китай). CD45.1 мишки на фона на C57BL/6 бяха любезно предоставени от Dr. Янюн Джанг от Института по здравни науки към Китайската академия на науките. Хетерозиготни мишки с дефицит на лептинов рецептор (Lepr db/+) на фона на C57BL/6 са закупени от Моделния център за изследвания на животни от Университета в Нанкин (Нанкин, Китай) и са отгледани в нашата лаборатория. Мишките STAT6 -/- (C.129S2-Stat6 tm1Gru/J) бяха от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME, САЩ). Всички експерименти са одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните към Института по здравни науки към Шанхайския институт за биологични науки към Китайската академия на науките.

Диета-индуцирано затлъстяване се извършва чрез хранене на 5-седмични мишки с HFD, съдържащ 60 kcal% мазнини (D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ, USA). Контролната група е хранена с ND. Тестът за включване на EdU е извършен с помощта на тестовите комплекти Click-iT EdU (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ) в съответствие с инструкциите на производителя. На мишките се дават 10 цт 3 часа преди умъртвяването. g EdU/g телесно тегло, инжектирано ip. Click-iT реакцията се провежда върху мастната тъкан и се анализира чрез поточна цитометрия и имунохистология. За да се определи приносът на резидентните макрофаги за натрупването на банкомати, долната част на корема на анестезирани мишки CD45.2 е екранирана с оловен блок с дебелина 6 cm. На тези мишки беше дадена радиационна доза от 9,5 Gy & ggr; изложени и инжектирани iv с 10 7 CD45.1 клетки от костен мозък. Химерните мишки бяха оставени за разтваряне в продължение на 7 седмици преди диетично лечение. За да се изследва ролята на IL-4 в пролиферацията на АТМ, на всяка мишка е дадена комбинация от 5 ug. g IL-4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, САЩ) и 25 ug. g IL-4 антитяло (клон 11B11, Harlan) ip инжектирани биопродукти за Science, Indianapolis, IN, USA) или PBS и ATM анализ бяха извършени 48 часа по-късно.

Проточна цитометрия

EAT и iAT се събират от умъртвени мишки, нарязват се на малки парченца и се изплакват с PBS в продължение на 1,5 часа с 2 mg/ml колагеназа I (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) преди разграждане. Плаващи адипоцити се разделят чрез центрофугиране на клетъчната суспензия при 600 х g за 10 минути. Палетите бяха ресуспендирани, филтрирани през 70 µm сита и червени кръвни клетки лизирани. Клетъчната суспензия беше предварително инкубирана с анти-CD16/CD32 (eBioscience, Сан Диего, Калифорния, САЩ), за да се блокират Fc рецепторите преди оцветяването на повърхностната молекула. Вътреклетъчното оцветяване се извършва с помощта на комплекти за фиксиране и проникване в съответствие с инструкциите на производителя (eBioscience). Моноклонални антитела на плъхове, включително F4/80, CD45, CD11b, CD45.1, CD45.2, Ki67 и TNF-a, бяха от eBioscience; CD115 и Siglec-F бяха от Biolegend (Сан Диего, Калифорния, САЩ).

За вътреклетъчно оцветяване на RELM- & agr; и TNF-? 1: 1000 GolgiPlug (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) е добавен към колагеназата по време на храносмилането в банкомати. След оцветяването на повърхностната молекула се извършва вътреклетъчно оцветяване с помощта на фиксиращ комплект и комплект за проникване в съответствие с инструкциите на производителя (eBioscience). Използвани бяха заешки анти-RELM-α (Abcam, Кеймбридж, Масачузетс, САЩ) и Alexa Fluor 488 конюгиран кози анти-заешки IgG (Life Technologies).

Имунохистохимия

Мастната тъкан се нарязва на малки парченца и се фиксира с 4% параформалдехид за 24 часа при 4 ° С. След това беше извършено пълно оцветяване. Накратко, пробите се проникват с 1% Triton X-100, блокират се с 1% BSA и 3% FBS в PBS и след това се инкубират с подходящи антитела към молекулите на повърхността или сърцевината. В някои експерименти адипоцитите са оцветени с BODIPY 558/568 C12 (Invitrogen).

Статистически анализ

Данните са представени като средна стойност ± SEM и значимостта е оценена чрез несдвоен двустранен t-тест, освен ако не е посочено друго. Разгледахме P ATM