Локализация, идентификация и изрязване на протокол за складиране на миши мазнини (преведен на немски)
Обобщение
Поради драстичната и отрицателна връзка между затлъстяването и други съпътстващи заболявания, изследванията за ролята на мастната тъкан при заболяванията и цялостното здраве са оправдани. Осигуряваме протокол за изолиране и отстраняване на депа с мастна тъкан, позволяващ изследването на мастната тъкан, използвайки in situ и in vitro методи.
Въведение
Затлъстелите се появиха забележително в светлината на медиите, поради драстичното нарастване на затлъстяването през последните десетилетия на 20-ти век. Понастоящем затлъстяването засяга повече от една трета от възрастните и 17% от децата и юношите в Съединените щати (САЩ) 1. За всички етнически групи статистическите изследвания около епидемията от затлъстяване показват, че неиспанските чернокожи имат най-висок процент на затлъстяване, коригиран към възрастта (49,5%) в сравнение с мексиканско-американците (40,4%) от всички латиноамериканци (39,1%) и неиспанците бели (34,3%). е и нарастващ интерес към здравната система. През 2012 г. беше изчислено, че годишните медицински разходи за грижи за затлъстяването в САЩ през 2005 г. са 190,2 милиарда щатски долара, което представлява почти 21% от общия бюджет за медицински разходи. За съжаление, изчислено е, че детското затлъстяване е отговорно само за преки медицински разходи на 14 милиарда долара. Статистически беше установено, че средните медицински разходи на лица с наднормено тегло са били $ 2,741 годишно по-високи от тези без тази 3-5 заболеваемост.
Затлъстяването е важен рисков фактор за различни заболявания като: диабет тип 2, нарушения на липидния метаболизъм, сърдечно-съдови заболявания, рак, мускулно-скелетни нарушения и хронично възпаление. Затлъстяването е дълбоко свързано с патогенезата на метаболитния синдром и други хронични заболявания 6-8. С такива драстични и отрицателни връзки между затлъстяването и други съпътстващи заболявания научните изследвания са насочили вниманието към настоящата епидемия и разнообразната и решаваща роля на мастната тъкан за по-добро разбиране.
В исторически план мастната тъкан се смяташе за несъществена и се разглеждаше като просто пълнеща тъкан. Понастоящем е показано, че мастната тъкан играе много важни роли във функцията на организма: метаболизъм, хормонален баланс, възпаление, защита и изолация 9. Мастната тъкан се състои предимно от адипоцити, но също така съдържа перицити, ендотелни клетки, моноцити, макрофаги и плюрипотентни стволови клетки 8. Мастната тъкан се състои от адипоцити разпределени през тялото в различни депа. Основните депа могат да бъдат намерени подкожно, подкожно, интрамускулно и висцерално 10. Мастните депа показват, че имат специфични за депото профили на веществата, които показват специфична депо чувствителност към затлъстяването и свързаните с това разстройства 8.
Традиционно мастната тъкан се класифицира в два основни типа: бяла мастна тъкан (WAT) и кафява мастна тъкан (BAT); въпреки че неотдавнашната литература показва наличието на трета група кръстена брита или бежова мастна тъкан 11. Доказано е, че мастната тъкан има различни цветове, свързани с морфологиите, метаболитните функции, биохимичните свойства и моделите на генетична експресия 10. Адипоцити в WAT единична, голяма капчица мазнина и променливи количества митохондрии. WATдоминант, открит в подкожни и висцерални местоположения на тялото. WAT действа предимно като място за съхранение на енергия и защита на органите. Адипоцитите в НДНТ имат мултилокуларна морфология и изобилни митохондрии. НДНТ се намира предимно в областта на шията и големите кръвоносни съдове на гръдния кош, както и 12-те лопатки. НДНТ функционира предимно в енергоемко поведение, което регулира термогенезата 7. Доказано е, че британската или бежовата мастна тъкан споделя аналогична морфология и експресия на НДНТ, но е доказано, че произхожда от бели мастни клетки 11.
Целта на протокола е да осигури точен метод за идентифициране и изолиране на различни видове мастни натрупвания от множество анатомични места.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
ЗАБЕЛЕЖКА: Всички тестове върху животни са проведени с одобрението на Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (IACUC) на Университета в Синсинати и в съответствие с Националния институт по здравеопазване Ръководство за грижа и използване на лабораторни животни (NIH Publication 85-23, Ревизиран 1996).
1. Евтаназирайте и стерилизирайте мишката
- Поставете мишката в кутия за капки, направена от надтерапутична доза изофлуран и оставете ефекта да вдиша. Веднага след като мишката бъде убита, извадете я от полето.
- Преместване на шийката на матката като второ средство за евтаназия.
- Стерилизирайте външната повърхност на мишката, като почистите животното със 70% етанол.
2. Идентифициране и изолиране на три различни депа на мастна тъкан
3. Изолиране на периваскуларна мастна тъкан (PVAt)
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
Идентифициране и локализация на ингвинална подкожна мастна тъкан, междускапуларна кафява мастна тъкан, висцерална мастна тъкан епидидимис (Илюстрация 1) както и аортната дъга, периваскуларната мастна тъкан, гръдната аортна мастна тъкан, съседната аортна мастна тъкан и инфраренальната мастна тъкан (Фигура 2) е постигнато успешно с помощта на описания хирургичен метод. Хистологичното изследване и диференциацията между пробите от НДНТ и WAT са положителни при оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) (Фигура 3) оценен. Анализът на РНК адипонектин (ADIPOQ), активиран от пероксизома пролифератор гама (PPAR-γ), предизвикващ клетъчна смърт DFFA-подобен ефектор a (CIDEA) и други специфични за мазнините маркери бяха измерени за всички горепосочени изолирани и изрязани депа (данните не са показани).
Първичните клетъчни линии от подкожните мастни клетки и периваскуларните адипоцити бяха култивирани и диференцирани от преадипоцити до адипоцити успешно за анализ на микрочипове. Култивираните преадипоцити се превръщат в адипоцити с оцветяване с маслено червено О (Фигура 4) одобрен. Беше постигнато успешно изолиране, култивиране и диференциация на мастните клетки за използване при in vitro проучвания и белтъчната активност беше успешно измерена. Ензимната активност на матричната металопротеаза-2 (ММР-2) беше измерена в третираната група в сравнение с контролата. Активността на MMP-2 се определя in situ в първична периваскуларна адипоцитна линия чрез зимография (Фигура 5) измерена.
Дискусия
Затлъстяването може да доведе до голямо разнообразие от съпътстващи заболявания и пълното разбиране на ролята, която играе затлъстяването, не е напълно изяснено; следователно са необходими допълнителни изследвания в областта на затлъстяването. Животински модели, особено миши модели, са идеални за предварителни изследвания на прогресията на заболяването и тестване на потенциални фармацевтични лечения. Когато се използват тези модели, точното отделяне и отстраняване на отлаганията на мастната тъкан е изключително важен и необходим инструмент при изследване на патологията на мастната тъкан, засягаща заболявания.
В настоящата литература за затлъстелите отлагания има значителна литература за метаболитното поведение и разликите между затлъстелите отлагания и техните анатомични местоположения. Малко са тези, които предлагат задълбочен метод за това как конкретно да се открият, идентифицират и изолират тези складове. Въз основа на прегледа на настоящите процедури за изолиране от мастна тъкан, има малка част от протоколите tcap, за да се предостави методология за това как да се изолират едно или две депа наведнъж. Точна техника, която позволява изолирането на множество депа с минимално количество подготовка и замърсяване, както и адресира различни методи за изследване на събраните проби, е този протокол 13-14.
В рамките на този метод има няколко стъпки, които са от решаващо значение за изолирането и чистотата на пробата. Почистването на инструменти, ръкавици и повърхности, често за премахване на косми и остатъци, е задължителна стъпка за избягване на замърсяването на депото. Когато разрязвате кожата по периметъра на мишката, за да изложите перитонеума за обезглавяване, е важно да не оставяте нищо да навлиза твърде дълбоко. Разрязването на перитонеума ще направи дегловирането много трудно и ще увеличи потенциала за замърсяване на пробата. Когато изрязвате депото на мастна тъкан SQ, е важно да идентифицирате триъгълните граници на депото, преди да изрежете някое от мастните тъкани. Също така трябва да се правят разфасовки внимателно, за да се избегнат мускулите и съседните съдове, жлези и мастна тъкан. Това ще предотврати замърсяването на пробата от алтернативна мастна тъкан, жлезиста тъкан, мускули или кръв.
Основното ограничение за изолирането и изрязването на депата на мастната тъкан, в тази процедура и други подобни процедури, може да бъде намерено в дефинирането на границите на определени депа. Поради лошо дефинираните граници в депата, например подкожните депа, изолирането на липсващото малко количество примеси от съседните мазнини може да бъде трудно. Друго ограничение може да бъде намерено в осигуряването на събиране на достатъчно тъкан в съдовете, свързани с депа, за допълнителни опити. Това ограничение понякога изисква обединяване на проби, въпреки че в зависимост от мястото на изолация и диетата, свързана с животното.
След като депата на мастната тъкан се изолират, те могат да се използват за различни анализи. Мастната тъкан може да се използва за молекулярни изследвания като експресия на протеин, ензимна активност и анализ на генна експресия. В допълнение, адипоцитът може да изолира първични клетъчни линии in vitro проучвания. Обезсмъртените клетъчни линии могат да се използват и за in vitro изследвания, но безсмъртните клетки не са толкова правдоподобни, колкото предимно отделни клетъчни линии. И накрая, мастната тъкан може да бъде твърда или замразена в ОСТ за хистологично изследване за идентифициране на левкоцитна инфилтрация, локализация на протеини и характеризиране на морфологията на адипоцитите.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.