Laborjournal онлайн Journalclub - вода в пътя
Карин Холихър
Марбург: Водните молекули са от решаващо значение за връзките между протеините и лигандите. Ето защо химиците и фармацевтите ги разглеждат отблизо.
Неутронна кристалография, калориметрия, енталпия, ентропия - това са лозунгите, към които буквално скача читателят на статията от Йоханес Шибел и колегите му от университета Филипс в Марбург (Nat. Commun. 9: 3559). Думи, които веднага подсказват: Тук се усложнява. „Нашите статии са почти винаги много трудни за четене“, казва старшият автор Герхард Клебе, който провежда изследвания в Института по фармацевтична химия към университета в Марбург. „Но ако прехапете, наистина ще получите нещо от това.“ Добре, приемаме поканата.
Клебе и колегите му от работната група за проектиране на лекарства искат да оптимизират активните фармацевтични съставки - и то не само от вчера. В професионалната кариера на Klebe почти всичко се въртеше около образованието и подобряването на лекарствените ефекти: изучаваше химия, една година в източника на неутрон в Гренобъл, постдокторанти по кристалография, над десет години в BASF, от 1996 г. в университета в Марбург и автор на високо оценения учебник " Дизайн на активна съставка ".
Протеините също трябва да премахнат водните молекули, за да свържат лигандите. Снимка: iStock/cactuseskimo
Най-новата публикация на неговата работна група също се занимава със сложните взаимоотношения на връзките между протеини и лиганди, по-точно с ензими и инхибитори. Експериментите са сложни - затова изследователите търсят „прост“ протеин: трипсин. Този ензим принадлежи към класа на сериновите протеази и може да се инхибира от N-амидинопиперидин и бензамидин.
Фармацевти и химици казват, наред с други неща, водата определя дали две молекули си пасват идеално като ключ и ключалка. Тъй като клетъчните протеини работят във воден разтвор и съответно са силно хидратирани, интуитивно е очевидно, че лиганд, който иска да се свърже, първо трябва да създаде пространство и да премести няколко водни молекули. Тази теза обаче все още не е напълно доказана експериментално. Поне потвърждението беше предоставено от ензима тромбин, също серинова протеаза, която е важна за съсирването на кръвта. След като отделни водни молекули бяха отстранени от свързващия джоб на тромбина, поведението на свързване на инхибиторите се подобри драстично. Това откритие доведе до разработването на по-ефективни антикоагуланти.
„Докато не знаем къде са водните молекули и как се променя тяхното положение, знанията ни за взаимодействието между протеините и техните свързващи партньори остават непълни“, обяснява Клебе. „Трябваше да използваме методите до краен предел, за да опишем поведението на водните молекули върху трипсина.“ И с това екипът на Марбург и колегите му в Генуа, Юлих, Хамбург и Мюнхен запълниха 15 страници - плюс добавка!
Изследването на свързването започна с термодинамични анализи. Дори отдавна да е известно, че термодинамичните фактори имат решаващо влияние върху поведението на свързване, те са малко проучени. Твърде сложно. Формулата, използвана за описание на термодинамичния процес, когато се свързват две молекули, изглежда наистина проста: ∆G ° = ∆H ° - T∆S °.
∆G, разликата в енергията на Гибс между свободното и свързаното състояние, определя реакцията. Тази разлика се състои от разликата между енталпията H ° и ентропията S °. Енталпията е всички енергии, съдържащи се в системата при постоянно налягане. Ентропията описва състоянието на реда в системата. Съгласно втория закон на термодинамиката, реакцията протича доброволно, когато ∆S клони към нула, т.е.G става по-малък поради реакцията.
Какво означава това за протеини и лиганди? Силната връзка винаги е свързана с малка енергия на Гибс, а разликата ∆G между свободните и свързаните молекули е очевидно отрицателна. Тази разлика в енергията може да бъде доказана като пренос на топлина с помощта на изотермична титруваща калориметрия (ITC). Свързващите партньори се титруват при постоянна температура и количеството топлина, което се генерира при образуването на комплекса, се измерва с калориметър. Днес калориметрите са толкова чувствителни, че могат да се използват за откриване на количество топлина от порядъка на микрокалориите. Измерването на топлината е прост експеримент и софтуерът на устройството доставя надеждно ∆H °, константата на свързване и по този начин също енергията на Гибс. Но това не е всичко. Здравата ядка е да се оцени: кои атоми или връзки правят кой принос към коя енергия се променя?
Ако лиганд измести силно фиксирана водна молекула и възникнат нови хидрофобни взаимодействия, печалбата в ентропията е по-голяма, отколкото ако по-малко здраво свързаната водна молекула трябва да отстъпи. „За съжаление обаче енталпията и ентропията често работят един срещу друг“, обяснява Клебе. За да се оптимизира връзка, следователно не е достатъчно да се модифицира лиганд по такъв начин, че само ентропията да намалява. „Трябва да се има предвид промяната в разликите между ентропията и енталпията.“
В Марбург Тобиас Вулсдорф, химик със способност за компютърни науки, наистина пусна пара в системата за термодинамична формула на връзката на инхибитора на трипсина. Той показа, че по-силното свързване на бензамидин в сравнение с пиперидиновия инхибитор е енталпично изгодно.
За да илюстрират ролята на водните молекули, авторите определят кристални структури. Обикновено за това се използват рентгенови лъчи. Според Клебе обаче това не е достатъчно чувствително, за да локализира точно водните молекули. Ето защо те използваха лъчение от неутронния източник в Техническия университет в Мюнхен. За неутронната кристалография са необходими много големи протеинови кристали. Правенето на това е изкуство. Със „златни пръсти“ ентусиазира Клебе, първият автор и след това докторант Йоханес Шибел създава трипсинови кристали - със и без лиганди. Клебе: „Най-страхотното при дифракцията на неутроните е, че лъчението не разрушава протеиновите кристали и измерванията могат да бъдат прекъснати и след това продължени. Така успяхме да измерваме върху кристал в продължение на седмици - с прекъсвания - и по този начин постигнахме разделителна способност по-малка от 1,5 ангстрема. Това са най-добре разрешените неутронни структури, които досега са били извършвани върху протеини с такъв размер. "
Научете повече за нашите нови продукти и поръчайте новия каталог 2021 днес на. Повече ▼
Но това не е всичко: химиците определят и рентгеновите кристални структури. Голямото предизвикателство беше да се извършат рентгенови измервания като дифракция на неутрони при стайна температура, така че данните да могат да се сравняват и комбинират след това. Клебе: „Успяхме да изчислим комбинирана X-N структура (бележка на редактора: X означава X-Ray, N за неутрони) от рентгеновите и неутронните данни и да я използваме с термодинамичните данни за компютърни симулации.“
Екипът откри девет водни молекули около аспартат 189 в свързващия джоб на трипсина. Три са директно в свързващия джоб на трипсина, други четири са повече или по-малко зад аспартата и служат като „резервоар“, ако една от вътрешните молекули е загубена. Което може лесно да се случи, тъй като вътрешните водни молекули не са толкова плътно свързани само с две водородни връзки, колкото външните с три. Останалите са малко по-далеч.
Изследователите от Марбург показват, че инхибиторът измества молекулата на водата, когато се свързва. В резултат ориентацията на друга водна молекула се променя: тя се доближава до тирозина 228, създавайки нова водородна връзка. В резултат на това той е по-здраво закрепен и вече не може да се върти свободно, което води до „ентропично наказание“, както пишат авторите. Тези и много други много подробни наблюдения показват кои водородни връзки и хидрофобни взаимодействия се разкъсват при сложно образуване и кои са новообразувани. Клебе: "Ние вярваме, че водните структури в протеина и състоянията на заряд върху аспартата са отговорни за различните афинитети на свързване на двата инхибитора с трипсин."
Опитът, който Klebe е придобил през годините в университетите и в индустрията, не трябва да се използва изключително в хартия в бъдеще. През март бивши служители на Klebe основават компанията CrystalsFirst с негова подкрепа. Целта е да се използва нова технология, известна като "SmartSoak", за да стабилизира протеиновите кристали, да определи тяхната 3D структура и по този начин да премине през събирането на кандидати за наркотици с помощта на софтуер. „По този начин геометричните данни, които са от съществено значение за съвременните фармацевтични изследвания, могат да бъдат доставени бързо и най-вече надеждно на много ранен етап от търсенето на наркотици, а големите усилия, свързани с търсенето на лекарства, значително намаляват“, се казва в прессъобщението на основателя на компанията. Да видим дали това ще се сбъдне.
(Непълната) работна група от химик Герхард Клебе (гръб, отворено яке) обича да ходи на обиколка: Те обичат особено кристалите - независимо дали в пещери или с протеини. Снимка: AG Klebe