Лабораторно списание - Преглед на продукта - Комплекти за пречистване на антитела
В академичните изследователски лаборатории антителата често се пречистват с помощта на афинитетни колони. Снимка: Университет на Флорида
(01.09.2020) Комплектите за пречистване на антитела се базират най-вече на малки въртящи се колони или топчета, снабдени с протеин А или G. Израелска група разработи интересна алтернатива без хроматография.
Какво би било съвременното изследване на науката за живота без поликлонални (pAb) или моноклонални антитела (mAb)? Не би останало твърде много от него, ако пренебрегнете и вездесъщата PCR. Едва ли има експеримент или анализ, при които малките помощници да не са част от партията и да улесняват живота на изследователите или да позволяват експериментите им на първо място. Антителата са не само необходими в основните изследвания за безброй методи и протоколи, вариращи от имуноанализи, Western blots, ELISA и имунохистохимия до микроскопия и изображения до поточна цитометрия. Те също са важни инструменти в клиничната диагностика и все повече се използват като активни съставки или терапевтични антитела за лечение на различни заболявания.
Един от най-важните източници на поликлонални антитела или имуноглобулини (Ig) е кръвната плазма на бозайниците. Въз основа на теглото, около двадесет процента от съдържащите се в него протеини са антитела, които са разделени в пет различни класа: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Първите три също играят важни роли в имунната система, но IgG и IgM се използват най-вече за изследователски цели. IgMs се появяват в ранната фаза на първичния имунен отговор към антиген, докато IgGs се синтезират в големи количества в последващия вторичен имунен отговор.
Изследователите се възползват от това, като инжектират антиген в зайци, кози, овце или други бозайници и след това обикновено изолират и пречистват IgG, образувани по време на имунния отговор от плазмата или антисерума на животните. В епохата преди кит те първо утаяват плазмените протеини с амониев сулфат, който добавят до крайна концентрация от 25 процента. След центрофугиране и отстраняване на протеините дойде ред на IgG, които бяха утаени с петдесет процента амониев сулфат.
Двата етапа на утаяване, както и последващата диализа на разтвора на антитялото, получен за да се отърве от амониевия сулфат, обаче изискват много ръчна работа и отнемат няколко дни. IgG могат да бъдат изолирани много по-бързо и лесно с комплекти за пречистване на антитела, които са почти изцяло базирани на малки афинитетни колони или зърна, снабдени с протеин А или протеин G. Първоначално от Staphylococcus aureus (протеин А) и Streptococcus sp. (Протеин G), получени повърхностни протеини се свързват с висока специфичност към Fc частта на много IgG.
Докато протеин G има висок афинитет към повечето IgG, протеин А е малко по-придирчив и едва ли се привлича от IgG от хамстери, плъхове или овце например. За афинитетно пречистване, рекомбинантно експресирани варианти на протеини А и G са прикрепени към хроматографските смоли или поотделно, или понякога в комбинация, или свързани към повърхностния материал на магнитни топчета. Често една стъпка на хроматография е достатъчна за постигане на чистота на изолираните антитела над 98%.
В изследователските лаборатории значително по-нестабилните IgM, които са склонни да се агрегират, често се почистват с афинитетни колони. Използваната тук свързваща матрица не е протеин А или G, а свързващият маноза протеин или свързващият маноза лектин (MBL), който е най-вече имобилизиран върху агароза.
За пречистване в по-голям мащаб, протеини А и G или други специфични лиганди за афинитетна хроматография са доста скъпо забавление. Поради това производителите на антитела и фармацевтичните лаборатории преминават най-вече към класическа йонообменна хроматография и пълнят колоните например с много по-евтини анионообменници като диетиламиноетил (DEAE) агароза, за да получат чисти IgG, IgM и по-специално моноклонални антитела (mAb). Но тези техники също трябва да се борят с общите недостатъци на хроматографските методи за пречистване - като ограничен капацитет на свързване, голям разход на време и скъпа поддръжка на устройствата.
Следователно някои групи упорито работят по алтернативи на хроматографските процеси, следвайки лозунга, който се чува все по-често: Всичко, само без хроматография (Всичко освен хроматография, ABC). Една от тези концепции за пречистване без антитела с хроматография беше представена миналата година от групата на Гай Пачторник от университета Ариел в Израел, заедно с колеги от Индия (MABS 11 (3): 583-92). Тъй като антителата могат да бъдат пречистени и с хидрофобна взаимодействаща хроматография (HIC), Пачорник предположи, че антителата очевидно се свързват малко по-силно с хидрофобните смоли, отколкото други водоразтворими протеини. Така че, според неговата идея, те също би трябвало да бъдат уловени с хидрофобни детергентни агрегати.
Служителите на Patchornik генерираха агрегатите, като първо добавиха хидрофобния хелатор батофенантролин (Batho) към воден разтвор на Tween-20 и завихриха сместа. Това им даде мицели Tween-20, чиито повърхности бяха украсени с хидрофобната част на молекулите Batho. След това те смесиха тези инженерни мицели с разтвор на железен сулфат и отново завихряха. След това по-нататъшната реакция протича практически автоматично: Fe 2+ йоните образуват хидрофобни (Batho) 3: Fe 2+ комплекси с молекулите Batho, разположени на фазовата граница между мицели и вода, което води до омрежване на мицелите, за да се образува хидрофобен Tween -20 агрегати.
Израелците тестваха дали агрегатите са подходящи за пречистване на антитела със смес от поликлонални човешки IgG, които съдържат лизат на Е. coli като изкуствено замърсяване. Процедурата за почистване, която са използвали за това, е много проста: сместа от антитела се инкубира в продължение на пет минути с предварително направените агрегати Tween-20 и след това се центрофугира в продължение на две минути. След това IgGs могат да бъдат изолирани от агрегатите за няколко минути, като се използва 50 милимоларен разтвор на изолевцин (рН 3.8). Цялото нещо работи и в безсерумна хибридомна среда, която обикновено се използва за производството на моноклонални антитела - както и в присъствието на говежди серумен албумин (BSA), който също често се среща в средите за клетъчни култури за производство на антитела.
Тъй като и чистотата на IgGs, изолирани с агрегатите Tween 20, и добивът са само незначително по-лоши, отколкото при афинитетна хроматография с протеин А, Пачорник е убеден, че неговият метод е реална алтернатива на конвенционалното пречистване. Той дори би могъл да си представи, че замества стълбовете на протеин А при пречистването на терапевтичните антитела.
Групата на Ana Cecília A. Roques от Университета Нова в Лисабон избягва хроматографско пречистване на антитела с комбинация от афинитетен лиганд, утаяване и магнитни наночастици (Biotechnol. J. DOI: 10.1002/biot.202000151).
Трите отделни техники, разбира се, не са нови. Новото обаче е тяхното сливане в това, което е известно като Магнитно утаяване по афинитет. По принцип това е изключително просто - най-сложната стъпка е производството на магнитни наночастици, оборудвани с триазинов лиганд, който специфично се свързва с антитела.
След това частиците се смесват с 20% PEG3350, който служи като утаител. Суровият екстракт се инкубира със сместа за един час при 4 ° С и се разклаща в орбитален шейкър. След това се прилага магнитно поле за петнадесет минути, за да се отделят утаените магнитни частици с прилепналите към тях антитела от супернатантата. С неутрален PBS разтвор, антителата след това се отстраняват внимателно от наночастиците.
Използвайки този метод, екипът на Roque изолира поликлонални антитела от човешки серум с 50% добив и чистота от осемдесет процента. Португалецът постигна още по-добри стойности за пречистване на моноклонални антитела.
(Първа публикация: H. Zähringer, Лабораторно списание 9/2020, от август 2020 г., цялата информация без гаранция)
Последни промени: 01.09.2020
© 1996-2020 Редакционно съдържание: LJ-Verlag GmbH & Co. KG, Фрайбург, дизайн и програмиране: f + r интернет агенция, Фрайбург,
Картини и графики - освен ако не е посочено друго - със съответните автори и фотографи.