Лаборатория 312
Лабораторна работа No 312
Определяне на арсеназо 1 и син декстран в тяхната смес.
FHMA, М. 2001, стр. 432-441
Кратко теоретично въведение:
Общи характеристики на метода
Гелна хроматография, или проникващ гел, или хроматография за изключване на размера е един от вариантите на течна хроматография, при койтохроматографираното вещество се разпределя между разтвораразтворителя, заобикалящ гранулите на сорбента (подвижна фаза), и разтворителя вътре в порите на гранулите на сорбента (невизуална фаза). Поради факта, че използваните в гел хроматографията сорбенти имат пори с различни размери, секциятав този случай зависи от съотношението на размерите на молекулите на веществата, които трябва да се отделят, и размерите на порите на сорбента. Освен размераров, който може да се вземе в първата пропорция на приближениенални молекулни тегла, съществена роля в гел хроматографиятаматографията играе формата на молекули. Този фактор е особено важен за полимерни разтвори, в които, когас еднакво молекулно тегло, молекулите могат да приемат различни форми (сферични или по друг начин) в съответствие с тяхната конформационна подвижност и в резултат на това теnomu се държат в колоната. Допълнителни разсъждения бяха валиднивие сте за сферични молекули.
При преминаване през колоната компонентите на сместа се разделятса разделени на фракции в съответствие с техните молекулни тегла; най-големите молекули първо се измиват (елуират)луги, особено тези, при които размерите на молекулите надвишават пътимерки на порите на сорбента, тъй като те не са в състояние да проникнат ви остават само в разтворителния слой, заобикалящ сорбента (външен обем). Когато измивате колоната с разтворител,скоростта на движение на такива молекули е максимална. По-малки молекули ще проникнат изцяло или частично в порите (в зависимост отразмер на порите) и целият процес на разделяне ще зависимрежа, в допълнение към размера на порите на сорбента, върху коефициента на дифузия на отделените молекули. Според уравнението на Айнщайн коефициентитескорост на дифузия дЗ. е обратно пропорционална на радиуса на частицата сорбент r:
където R е универсалната газова константа; Т- абсолютни темитемпература; η е вискозитетът на средата; нA - Номер на Авогадро.
В зависимост от свойствата на хроматографираните материалиСъединенията в гел хроматографията използват хидрофилни или хидрофобни сорбенти с твърда, полутвърда и мека матрицаtsey. Меките декстран гелове (сефадекси и молселекти), полиакриламидни гелове се използват като хидрофилни сорбенти.дали (биогелове), хидроксиалкил метакрилатни гелове (сферони) и т.н.същите макропорести силикагели и макропорести стъкла (твърди сорбенти). Използват се някои хидрофобни сорбентинякои видове сефадекси, полистиролови гелове (стирогел, порогел), поливинилацетатни гелове, а също силициев диоксид и макросиво стъкло (боядисано).
Основното изискване за работата на сорбенти в гел хроматографиятаphii - за изключване на адсорбцията и йонообмена на отделени веществавещества, тоест разделянето трябва да става само поради размера на молекулите. Сред хидрофилните сорбенти най-приложиминие сме декстран гелове - Sephadex. Като се използва Sephadex като пример, по-долу са разгледани физикохимичните основи на задържане в гел хроматографията, които са валидни за всички други сорбенти в този хроматографски метод.
Декстран е разтворим линеен полизахарид с молекуламаса до 10 милиона, много хидрофилна поради високата-то съдържание на хидроксилни групи. При частична хидролиза в разредена киселина декстранът се разлага на фракции, катос различни молекулни тегла. Чрез взаимодействие на декстран с епихлорохидрин се получава триизмерен, неразтворим във вода гел, наречен Sephadex. Той се предлага под формата на гранула. Степента на подуване и размерът на порите във фракцията Sephadex зазависят главно от степента на омрежване на линейния полимер на декстран и неговото молекулно тегло. Колкото по-силно е подуването на водата на фракциите Sephadex, толкова по-големи са порите и толкова повече болкапо-големите молекули могат да бъдат разделени на дадена фракция.
Сефадексите практически нямат химически ефект върху изследваните вещества и не променят тяхната природа. Те са устойчивичувствителен към органични разтворители, към разредени разтвори на киселини и основи в рН от 2 до 10.
Разтворителят в колона, пълна със сорбент, като гел, се състои от неподвижна фаза (разтворителят в порите на гела) и подвижна фаза (разтворителят между гранулите на гела). Общ обем на геловата колона (обем на колоната) Vт се състои от външноth обем (обемът на разтворителя между гранулите, т.е.фаза) Vo , вътрешен обем (обемът на разтворителя вътре в гранулите, т.е. стационарната фаза) VЗ. и обемът на сухия гел (обемът на матрицата) Vm:
V стойностотносно определя се чрез преминаване на високото молекулно тегло през колонаталюбопитно вещество, което не може да проникне в гранулите на гела, т.е. размерът на молекулите на който е по-голям от размера на порите на гела. Обем на разтворакоито са преминали през колоната от момента на кандидатстване високомолекулно вещество, докато максималната му концентрация се появи в елуата на изхода на колоната, точно отговаря на външния обем Vo. Стойност VЗ. определя се по формулата: