Колекция дъх от деца за заболяване Протокол за откриване на биомаркер (преведен на немски)

Обобщение

Този протокол описва прост метод за получаване на проби от дъх от деца. Накратко, пробите от смесен въздух се концентрират предварително в сорбентни епруветки преди анализ на газова хроматография-масспектрометрия. Дихателните биомаркери на инфекциозни и неинфекциозни заболявания могат да бъдат идентифицирани с помощта на този метод за събиране на дъх.

Резюме

Въведение

Биомаркерите могат да носят ценна информация за нормалните и патологични биологични процеси, които могат да допринесат за клинично установимо заболяване. Напоследък нараства интересът към оценката на летливите вещества в дишането като биомаркер за различни болестни състояния, включително инфекции, метаболитни нарушения и рак 1. Издишаният въздух съдържа количествено измерими летливи органични съединения (ЛОС), полулетливи органични съединения и получени от микроби материали (например нуклеинови киселини от бактерии и вируси). Основната цел на анализа на издишания въздух е неинвазивен поглед върху състоянието на заболяването и/или влиянията върху околната среда. Има няколко метода за събиране и анализ на издишания въздух, в зависимост от компонентите, които представляват интерес. Понастоящем няма стандартизиран метод за изследване на издишания въздух, който затруднява сравнителния анализ на резултатите от изследванията. Стандартизирането на процедурата за събиране на дъх е важно, тъй като самата процедура за вземане на проби има значително влияние върху резултатите от дъха надолу по веригата.

В много проучвания се използва вземане на проби от късен дихателен път 2, 3. Този избор включва изхвърляне на първата част от издишания въздух („мъртвото пространство“), за да се улови предимно въздухът в края на дихателния цикъл. Предимството на тази стратегия е, че тя минимизира нивото на екзогенни ЛОС (напр. Екологични ЛОС), като същевременно обогатява за ендогенни, специфични за пациента ЛОС. Този метод не позволява на индивида да издиша през първите няколко секунди, преди да вземе пробата от дъха. Други изследователи са използвали сензор за налягане, за да активират вземането на проби в предварително определена фазова последователност 4, 5. Тъй като сензорите за налягане изискват сложна технология, този алтернативен метод изисква специално и относително скъпо оборудване за вземане на проби.

Вземането на проби от дишане при деца може да бъде особено трудно. Основна загриженост е, че малките деца може да не могат да работят с трупи за доброволно издишване на въздуха "мъртво пространство". Поради това е по-лесно да се получи смесено дишане от дихателните пътища от децата. Важно ограничение обаче при смесените проби от дихателните пътища е рискът от замърсяване на околната среда и материалите. Следователно, осъществимостта на педиатричното събиране е водещ проблем в тази област.

В допълнение към методите за събиране на данни, задържането на проба от дъха може също да повлияе на качеството на пробата. Високата влажност на въздуха при издишване и свръхниските концентрации (части на трилион) летливи органични съединения правят пробите от дъха особено податливи на проблеми, свързани с паметта 6, 7. Въпреки големия потенциал на техниките в реално време, като например реакция на протон-трансфер-масова спектрометрия (PTR-MS), GC-MS остава златният стандарт за анализ на пробите от дъха. Тъй като GC-MS анализът на дихателни проби е офлайн техника, той е съчетан с методи за предварително концентриране като тръби за термична десорбция (TD), екстракция на микро твърда фаза и устройства за улавяне на игла. Дихателните проби трябва да се съхраняват временно в полимерни торбички 8 преди предварителната концентрация. Полимерните чанти са популярни поради умерената им цена, относително добра издръжливост и многократна употреба. Въпреки че торбите могат да се използват повторно, са необходими време и усилия, за да се осигури ефективно почистване 7, 8. Всяка конкретна чанта също изисква емпирично определени и стандартизирани процедури за контрол на качеството, повторна употреба и възстановяване.

TD тръбите се използват широко за предварително концентриране на дишането, тъй като улавят голям брой летливи вещества и могат да бъдат персонализирани. Абсорбиращите материали, използвани за опаковане на TD тръби, могат да пригодят специфични приложения и специфични целеви летливи вещества от интерес. TD тръбите значително подобряват удобството на изследванията на биомаркер за дишане, особено в отдалечени пасища, тъй като TD тръбите безопасно съхраняват летливи дихателни вещества за най-малко две седмици и са лесни за транспортиране 3 .

В опит да стандартизираме събирането на педиатричен дъх за откриване на биомаркери, тук описваме прост метод за събиране на вдишвания от деца. За да се илюстрират представителните резултати от внедрените протоколи, анонимизирани данни се представят на продължаваща кохорта от деца (на възраст 8-17 години) при оценката за безалкохолно мастно чернодробно заболяване (NAFLD). Пълните резултати и анализ на това проучване ще бъдат докладвани в по-късна публикация. По този начин ние докладваме за подмножество от данни, за да демонстрираме прилагането на нашия протокол. Накратко, децата са инструктирани да издишват нормално през мундщука в полимерен плик, сякаш „духат балон“. Процесът се повтаря 2-4 пъти, докато се събере 1 L дъх. След това пробата се прехвърля в TD тръба и се съхранява при 5 ° C преди GC-MS анализ.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Изследването е одобрено от Институционалния съвет за преглед на Медицинския факултет на Университета във Вашингтон (# 201709030). Съгласието е получено от родител или настойник преди записване в проучването. Снимки на фигура 2 възпроизведени с писменото съгласие на родителите.

(3) Предаване на дишане на тръби за термична десорбция

  1. Вземете проби от околния въздух около пациента веднага след издишването.
    1. Поставете торбата на изхода на помпата с маркуч, както в допълнителна фигура 5показани.
    2. Сгънете стеблото на клапанната торба надолу, за да отворите входящия възел за вземане на проби.
    3. Заключете отворения клапан, като завъртите назъбения винт от страната на входящия фитинг по посока на часовниковата стрелка.
  2. Включете помпата и работете при 100 ml/min за 12 минути. Помпата ще събира 1200 ml от околния въздух.
  3. След като желаният обем се събере, разхлабете назъбения винт от страната на входящия възел, като го завъртите обратно на часовниковата стрелка и натиснете стеблото на клапана, докато входящият фитинг завърши.
  4. Заключете джобния вентил, като завъртите по часовниковата стрелка назъбения винт на палеца отстрани на входящия фитинг затворен.
  5. Изключете чантата от помпата.
  6. Същите стъпки като в раздел 3. Единствената разлика е, че околният въздух, летливите органични съединения се пренасят, а не тези на дъха.

ЗАБЕЛЕЖКА: Условия за анализ на проби от дъх и въздух са описани в 9.

  1. Анализирайте събраните данни и идентифицирайте съединенията в хроматограмите. Използвайте типични софтуерни програми, за да намерите и осъществите всички връзки, направени от инструмента (Фигура 3А) разпознат. Например функция за деконволюция за идентифициране на съединения. Данни за филтриране с фактор за размер на прозореца за задържане 80, филтър за височина на масата ≥100 броя и композитен абсолютен филтър за площ ≥500 броя.
  2. Използвайте химични стандарти за идентични съединения в пробите за дъх и въздух. Екстрахирайте площта на пика на основния йон от съединенията от интерес, като изопрен и β-пинен (Фигура 4) и сравнете летливите нива в дъха и въздуха.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

В нашето проучване пробите за дишане, събрани от 10 деца (на възраст 8-17 години), в момента се оценяват в детската болница Сейнт Луис. Пробите от дишането и околния въздух (n = 10) бяха събрани, както е описано по-горе. Пробите бяха анализирани с помощта на газова хроматография, квадруполна масова спектрометрия за време на полет (GC-QToF-MS) и термична десорбция, както е описано по-горе 9. След отстраняване на фоновите замърсители, внедрените протоколи доведоха до средно 311 летливи органични съединения (VOC) във всяка от смесените проби издишан въздух. Средно са открити значително повече ЛОС в пробите за дъх в сравнение с контролите на околната среда/околната среда (311 ± 11,5 срещу 190 ± 12,6, p Фиг. 3А). Увеличеният брой на ЛОС в дъха, в сравнение с околния въздух, видимо се характеризира с представителни общи йонни хроматограми (TIC) (Фиг. 3 b) за сравнение.

Като мярка за успешен контрол на качеството на събиране на дъх, нивата на две ЛОС с общ дъх (изопрен и β-пинен) в сравнение с регулаторите на въздуха Zimmer (Фигура 4). Изопренът, един от най-разпространените ЛОС в дъха, обикновено се намира в нива на части на милиард (ppb) (131 ppb), докато β-пиненът се намира в нива под-ppb (0,59 ppb) 6. И двете съединения са установени в дъха на здрави възрастни в сравнение с ниските нива, присъстващи във въздуха в помещенията, което показва, че нормалните физиологични процеси са обогатени като основен източник на тези анализи в дъха 6. По това време изопренът (m/Z 67) се задържа за 2,12 минути и β-пиненът (m/Z 93) се задържа за 14,4 минути. Откриваме, че изобилието от проби за дишане на изопрен при деца е било 10 пъти по-голямо от това в стайните регулатори на въздуха (Фиг. 4; средната пълнота ± SEM са 4.2x10 5 ± 1.0x10 5 и 3.9x10 4 ± 0.9x10 4 за дъх и въздух и p = 0.0003) и β-пиненът показва 3 пъти по-висока пълнота в дъха от въздуха (моята пълнота ± SEM са 3.0x10 4 ± 1.3x10 4 и 9.1x10 3 ± 1.6x10 3 за дъх и въздух, съответно p = 0.007), потвърждава успешното събиране на дъх. Пълният описателен анализ на откритията на Biomarker Discovery от това проучване ще бъде докладван в бъдеща публикация.

протокол
Фигура 1: Пробоотборник за дишане и чанта за събиране на издишан въздух, взети заедно. Вземач на проби за вдишване (със отворен син клапан, т.е. обозначен с двустранната червена стрелка, успоредна на щепсела) и торба, свързана с маркуч, готов за вдишване. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

протокол
Фигура 2: Издишване на дете в дъх в торбичка за събиране на дъх. (А.) Деца със задържане на въздух, издишване и (Б.) предлага проба дъх в джоба. Снимка на учтивост. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

деца
Фигура 3: Летливи дишащи въздух. (А.) Брой различни летливи съединения във всяка проба от дишане от педиатрични пациенти (n = 10) и контрол на околния въздух (n = 10). Показват се средните стойности и стандартните грешки на средната стойност (SEM). (Б.) Общ йонен хроматограф (TIC) на представителни педиатрични проби за дишане спрямо въздушен контрол за визуализация. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

заболяване
Фигура 4: Пълнота на две летливи издишани въздуха. Изобилие от изопрен и β-пинен в проби от дъх от педиатрични пациенти (n = 10) и регулатори на въздуха Zimmer (n = 10). Пълнота, количествено определена от площта на пика на йонната основа. Показват се средните стойности и SEM. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

Допълнителна фигура 1: Пробоотборник за дишане. Вляво: (A) пробоотборник за дишане, сглобен: 1) мъжки адаптер + съединител (2) двупосочен сферичен кран + 3) тефлонов мъжки адаптер. (B) Мундщук от картон. (C) маркуч с малък и голям диаметър. Вдясно: Пробоотборник за дишане с прикрепен мундщук и тръби. Моля, кликнете тук, за да изтеглите този файл.

Допълнителна фигура 2: Различни обеми на дишане. По-горе има изображения на колекционерска торба, пълна с различни количества въздух (1 L, 2 L и 2,5 L), като визуално представяне на приблизителните обеми на дишане, които трябва да бъдат събрани. Моля, кликнете тук, за да изтеглите този файл.

Допълнителна фигура 3: Клапан на джоба. Вляво: стеблото на клапана е надолу (джобният клапан е отворен). Заключете джобния вентил, като завъртите по часовниковата стрелка назъбения винт на палеца отстрани на входящия фитинг затворен. Чантата е готова за събиране на дъх. Вдясно: стеблото на клапана е отгоре (джобът на клапана е затворен). Моля, кликнете тук, за да изтеглите този файл.

Допълнителна фигура 4: Прехвърляне на дъх. Вляво: Сорбентна тръба (1), прикрепена към единия край на торбата с тръби с малък и голям диаметър, а от другия край към помпата. Вдясно: Забележете набразден край на сорбентната тръба; набразденият край трябва да сочи към колекционната чанта. Моля, кликнете тук, за да изтеглите този файл.

Допълнителна фигура 5: Събиране на околния въздух. Отляво: Помпа с две връзки: вход и изход. Изходният отвор е включен в колекционната чанта. Входният отвор ще изтегли околния въздух и ще го прехвърли в чантата. Вдясно: Създадена е система за събиране на атмосферния въздух. Моля, кликнете тук, за да изтеглите този файл.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Въпреки значителния напредък в изследванията на дишането през последното десетилетие, стандартизираните процедури за вземане на проби и анализ на летливите газове от дъха остават недефинирани 10. Една от основните причини за тази липса на стандартизация е разнообразието от методи за събиране на данни за дишането, които имат пряко въздействие върху полученото химическо разнообразие във всяка дадена проба издишан въздух. Atem издишайте съдържа широка гама от летливи органични съединения в много различни концентрации 6. Следователно, промяната на методите на изследване не само ще промени изобилието, но и разнообразието от вещества, които могат да присъстват в пробата.

Вземането на проби от дихателни газове е изненадващо сложно. Докато субектите трябва да издишват в мундщука на колектор или в газонепроницаем контейнер преди анализ, вземането на проби от дъха трябва да вземе предвид и да вземе предвид редица възможни променливи. В тази работа ние демонстрираме специфичен, валидиран протокол за обгазяване на дъха при деца. Досега успешно внедрихме този протокол с фебрилни деца на възраст до 4 години, в полеви сценарий в среда с ограничени ресурси (Малави), слънчева топлина в нашето дихателно проучване и анализ на тръбопроводи за откриване на биомаркери - 9. След това внедрихме и оценихме нашите протоколи за събиране на проби от дишане от деца, подложени на оценка, в съвременна допълнителна педиатрична клиника в САЩ. Нашите резултати показват, че за идентифицирането на детски биомаркери за дишане събирането на смесен въздух е от решаващо значение, тъй като осигурява истински „отпечатък на дъха“ от даден индивид. В допълнение, смесеният дъх на издишване е и най-лесният тип дишане, който може да се постигне, тъй като всички фази на издишания въздух (устата и носа) се придобиват 3.

На полето, и особено когато субектите са остро болни, може да бъде трудно да се контролират често срещани смущаващи фактори като диета, телесна температура и/или използването на парфюми или кремове с конкретен обект. Тези фактори могат да имат силен ефект върху обема и качеството на дишането. Поради тази причина препоръчваме на изследователите не само да записват времето на задържане на дъха и доставянето му в сорбентните тръби, но също така да вземат под внимание и други специфични за пациента фактори като диета (напр. 24-часово изземване на диета), използване на вода за уста и употреба на лекарства, за конкретна оценка на ефектите от тези потенциални объркващи фактори по време на откриването на биомаркери и последващи анализи.

Вдишаните съединения от околния въздух също влияят върху състава на издишания въздух, което може да представлява предизвикателство за усилията за откриване на биомаркер за дишане. Следователно анализът и записът на атмосферния въздух дават критичен контрол, важни знания за произхода на летливите вещества в издишания въздух. Например летливите профили на атмосферния въздух са използвани, за да се определи дали даден дъх е летлив при по-висока или по-ниска пълнота на дишане в сравнение с околния въздух 11. Следователно определено съединение за дишане се счита за получено от тялото (напр. От ендогенен произход), ако концентрацията е по-висока в дъха, отколкото във въздуха, докато по-ниската концентрация в дъха показва, че това вещество е получено от околната среда (напр. екзогенен произход). Сравняването на летливото изобилие в дъха и въздуха в помещенията също служи като важен положителен контрол за това дали събирането на дишане е адекватно. Както в нашите представителни данни (Фигура 4) демонстрира, че летливото съединение изопрен е от ендогенен произход и трябва да присъства в пробите за дъх в концентрации> 10 пъти по-високи от околния въздух 6 .

За откриването на биомаркери летливите профили на хора с условия, които представляват интерес, трябва да се сравняват с балансиран здрав контролен човек, така че моделите да могат да бъдат идентифицирани с помощта на статистически методи като машинно обучение и многовариатен анализ. Методът за събиране на дъх, описан тук, може да се приложи при различни патологични състояния; единственото изискване е детето да се включи доброволно с вземане на проби. Тъй като дихателното тестване е неинвазивно, просто повтарящо се и се равнява на артериални концентрации на биологични вещества, то има големи обещания за прилагане при тестване за клинична употреба.

Бъдещата работа ще се фокусира върху разработването на нови методи за събиране на дъх при малки бебета и деца (Изисква се абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Разкриване

Авторите не са разкрили нищо.

Благодарности

Благодарим на децата и семействата на детската болница Сейнт Луис, които участваха в това проучване. Ние признаваме уникалните усилия на г-жа Стейси Постма и г-жа Джанет Соколич по време на Колекцията на дъха. Тази работа е подкрепена от Фондация за детска болница в Сейнт Луис.