Клониране
Какво ще кажете за ваш клонинг? Някой, който става сутрин и ходи на училище за вас, прави домашните и подрежда стаята, така че да имате достатъчно време за киното? Страхотна идея или може би не?
4. Инструментите за клониране на гени
Изследователите използват различни молекулярни инструменти за клониране. Рестрикционните ензими (по-точно рестрикционните ендонуклеази), които могат да разпознават и режат ДНК в определени позиции, са незаменими. Рестрикционните ензими се намират в бактериите и могат да бъдат сравнени с кучетата пазачи: Те предпазват бактериите от проникването на вируси. Рестрикционните ензими разпознават вирусната ДНК и я разграждат в процес, наречен рестрикция. Рестрикционните ензими могат да правят разлика между вашата собствена и чужда ДНК, защото вашата собствена ДНК е химически маркирана от метилова група, която работи като флаг. Чуждото ДНК обаче не носи това знаме.
Рестрикционните ензими работят изключително специфично: Те разпознават къси ДНК последователности и прерязват ДНК нишката в този момент. Рестрикционен ензим, често използван от изследователите в експериментите, се нарича Eco RI, първият рестрикционен ензим, открит в бактерията Escherichia coli (Е. coli). Той разпознава и отрязва GAATTC последователността, оставяйки след себе си така наречените лепкави краища (вижте последователността на филма „Рекомбинантна ДНК технология“). Създадените по този начин парчета ДНК (фрагменти) могат да бъдат свързани относително лесно помежду си (виж фигура 2.1).
В допълнение към рестрикционните ензими, плазмидите са друго средство за клониране. Плазмидите са „генни таксита“: те могат да поемат чужда ДНК и да я прехвърлят на бактерии. Бактерии, напр. След това Е. coli поемат производството на гени и протеини. Бактериите на Е. coli са основните тестови организми в много лаборатории и са най-добре изследваните живи същества.
За да накара клонирането да работи, изследователите използват трик: Използваните плазмиди също имат ген, който дава на бактериите, които поемат плазмидната резистентност към антибиотика ампицилин. Тази съпротива ще се окаже важна по-късно.
В нашия експеримент рестрикционният ензим Eco RI отрязва човешката ДНК, която сме получили от пробата на слюнката. Това създава хиляди парчета ДНК - една от които съдържа инсулиновия ген, който търсите. Използваме същите ензими, за да режем бактериалните плазмиди. Поради лепкавите краища можем да поставим отделните парчета обратно. Много плазмиди няма да вземат нищо, мнозина ще вземат човешка ДНК, а някои ще вземат търсения ген на инсулина. След това всички плазмиди се въвеждат в бактериите на Е. coli.
Сега разпределяме всички бактерии в чиния с хранителна среда, върху която по принцип бактериите не могат да растат, тъй като плочата съдържа антибиотика ампицилин. С тази стъпка пшеницата се отделя от плявата: Всички бактерии, погълнали плазмид, могат да растат на плочата и да образуват колония, тъй като плазмидът ги прави устойчиви на ампицилин. Бактериите се размножават и заедно с тях желаният инсулинов ген.
Към този момент клонирахме хиляди парчета човешка ДНК, а не само тези, които ни интересуват. Следващата стъпка, скринингът на всички колонии, е много сложна.
Как можем да намерим този, който носи нашия инсулинов ген от всички хиляди клонинги? Ако вече знаем част от ДНК последователността на инсулиновия ген, тогава можем да произведем парче мРНК с дължина около 30 двойки основи, което ще се прикачи към генната последователност на инсулина като сонда. Тази сонда е радиоактивна или е маркирана с флуоресценция, за да можем да определим с кои клонове се скачи. Благодарение на тази сонда намираме клонинга, който съдържа нашия инсулинов ген (виж фигура 2.2). Много други гени могат да бъдат клонирани с помощта на тази техника, напр. за хормони на растежа и интерферон, генни продукти, които също се използват като лекарства.
Клонирането на гени вече е успешно завършено и става ясно защо бактериите се използват за този, а не висшите организми: висшите организми се размножават по полов път. За тези живи същества сексуалността има предимството, че генетичният състав е рекомбиниран и че от него се появяват нови индивиди с нови характеристики. Това създава предимства в еволюцията. За изследователите обаче тази нова генетична комбинация е разрушителна, тъй като може да промени и инсулиновия ген.
Изследователите трябва да работят с животни, които са генетично идентични: само клонингите винаги реагират по един и същи начин в експеримент. Когато изследователите искат да тестват лекарство, те винаги използват мишки от същия щам. Такива щамове на мишки се отглеждат с помощта на инбридинг или близко свързани животни се кръстосват помежду си.