Клетъчна диференциация - хора - хранене - околна среда

Принцип на колориметрично откриване с p-нитрофенол Метаболизъм на pNPP до жълт p-нитрофенол чрез мембранно-свързани алкални фосфатази на живите клетки.

Анализът на р-нитрофенол фосфат (анализ на pNPP) е използван за първи път от Engvall et al. (1980) и се използва за определяне на степента на диференциация между прилепнали и неприлепнали клетки. pNPP е субстрат на алкална фосфатаза (AP). След хидролиза на фосфатните остатъци от фосфатазата се получава р-нитрофенол като жълт, разтворим краен продукт. След прекратяване на реакцията чрез добавяне на разтвор на натриев хидроксид, интензивността на оцветяването може да се определи колориметрично в ELISA четеца при дължина на вълната 405 nm. Образуването на жълтия продукт е пропорционално на активността на алкалната фосфатаза.

среда

Горно ляво изображение.

Принцип на флуорометрично откриване с флуоресцеин дифосфат (FDP)

Като мярка за оценка на степента на диференциация, активността на алкалната фосфатаза може също да бъде определена флуориметрично.
В този случай се използва флуорометричното багрило флуоресцеин дифосфат вместо колориметричното багрило p-NPP. Алкалната фосфатаза е в състояние да освободи флуоресцеин от това съединение, което след това може да бъде измерено флуориметрично (напр. 485nm/Em 538nm) в многопластовия четец.

Опитна оценка

1. Определяне на съдържанието на протеин в пробата с помощта на Брадфорд
2. Измерете абсорбцията или флуоресценцията на пробите
3. Изчисление като µM p-NP или флуоресцеин/min/mg протеин

Фигура горе вдясно.

Разходи (колориметрично доказателство)

Разходи (флуорометрично доказателство)

Примери за приложение

Изследвания за регулиране на събитията на диференциация в контекста на хомеостазата на клетките и тъканите след добавяне на флавоноиди или олигозахариди (Kuntz et al. 2007 и 1999)